| 摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-15页 |
| 本论文的缩写词汇表 | 第15-16页 |
| 第一章 绪论 | 第16-48页 |
| ·古菌概述 | 第16-19页 |
| ·古菌Sulfolobus tokodaii strain 7 介绍 | 第18-19页 |
| ·DNA损伤方式 | 第19-20页 |
| ·DNA损伤方式 | 第19页 |
| ·DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs) | 第19-20页 |
| ·DNA双链断裂修复方式 | 第20-34页 |
| ·非同源重组修复途径 | 第20-21页 |
| ·同源重组修复途径 | 第21-34页 |
| ·细菌同源重组修复途径 | 第22-25页 |
| ·真核生物同源重组修复途径 | 第25-30页 |
| ·古菌同源重组修复 | 第30-34页 |
| ·解旋酶 | 第34-38页 |
| ·解旋酶 | 第34页 |
| ·解旋酶的分类 | 第34-35页 |
| ·解旋酶的作用机制 | 第35-38页 |
| ·"主动滚动(active rolling)"模型 | 第35-36页 |
| ·"尺取虫(inchworm)"模型 | 第36-38页 |
| ·硫化叶菌遗传操作系统 | 第38-47页 |
| ·转化方法 | 第39-40页 |
| ·转化方法 | 第39-40页 |
| ·转化效率 | 第40页 |
| ·选择标记 | 第40-42页 |
| ·抗生素选择 | 第41页 |
| ·尿嘧啶筛选 | 第41-42页 |
| ·乳糖选择 | 第42页 |
| ·受体菌株 | 第42-44页 |
| ·遗传稳定性 | 第42-43页 |
| ·限制/修饰活性 | 第43页 |
| ·硫化叶菌Sulfolobus复制子的宿主范围 | 第43-44页 |
| ·穿梭载体 | 第44-45页 |
| ·穿梭载体 | 第44页 |
| ·穿梭载体的应用 | 第44-45页 |
| ·报告基因 | 第45-46页 |
| ·硫化叶菌Sulfolobus中蛋白表达所使用的启动子及亲和标签 | 第46页 |
| ·总结 | 第46-47页 |
| ·本论文开展的思路 | 第47-48页 |
| 第二章 超嗜热古菌Sulfolobus tokodaii解旋酶StoHerA纯化及生化性质分析 | 第48-69页 |
| ·材料与方法 | 第48-54页 |
| ·菌株与质粒 | 第48页 |
| ·试剂 | 第48页 |
| ·主要仪器设备 | 第48页 |
| ·培养基 | 第48页 |
| ·主要试剂配方 | 第48页 |
| ·S.tokodaii基因组DNA的提取 | 第48-49页 |
| ·大肠杆菌DH5α与BL21-CodonPlus(DE3)-RIL感受细胞的制备 | 第49页 |
| ·S.tokodaii解旋酶herA基因克隆 | 第49-51页 |
| ·PCR扩增herA基因片段 | 第49页 |
| ·PCR产物回收 | 第49页 |
| ·PCR产物或质粒双酶切反应 | 第49-50页 |
| ·双酶切反应片段回收 | 第50页 |
| ·DNA连接和转化 | 第50页 |
| ·连接反应所得阳性克隆筛选 | 第50-51页 |
| ·蛋白的表达与纯化 | 第51-52页 |
| ·DNA底物准备 | 第52-53页 |
| ·ATPase活性检测 | 第53页 |
| ·ATPase活性检测原理 | 第53页 |
| ·ATPase活性检测方法 | 第53页 |
| ·DNA与蛋白结合原理和检测 | 第53-54页 |
| ·DNA与蛋白结合实验原理 | 第53-54页 |
| ·DNA与蛋白结合活性检测 | 第54页 |
| ·DNA解旋酶检测原理和方法 | 第54页 |
| ·DNA解旋酶酶检测原理 | 第54页 |
| ·DNA解旋酶检测方法 | 第54页 |
| ·结果与分析 | 第54-68页 |
| ·StoHerA基因克隆、表达和纯化 | 第54-56页 |
| ·StoHerA蛋白形成聚体大分子形式 | 第56-58页 |
| ·StoHerA蛋白ATPase活性检测 | 第58-60页 |
| ·StoHerA蛋白DNA结合活性检测 | 第60页 |
| ·StoHerA蛋白解旋酶活性检测 | 第60-65页 |
| ·StoHerA蛋白保守残基的点突变分析 | 第65-68页 |
| ·StoHerA点突变体的ATPase活性检测 | 第65-66页 |
| ·StoHerA点突变体的DNA结合活性检测 | 第66-67页 |
| ·StoHerA点突变体的DNA解旋酶活性检测 | 第67-68页 |
| ·小结 | 第68-69页 |
| 第三章 解旋酶StoHerA与核酸酶StoMre11相互作用的研究 | 第69-81页 |
| ·材料与方法 | 第69-74页 |
| ·材料 | 第69页 |
| ·构建重组质粒 | 第69-71页 |
| ·构建pET15b-StoMre11重组质粒 | 第69-70页 |
| ·StoHerA与StoMre11蛋白体外结合实验 | 第70-71页 |
| ·酵母双杂交实验(yeast two-hybrid analysis) | 第71-73页 |
| ·酵母双杂交原理 | 第71-72页 |
| ·实验方法 | 第72-73页 |
| ·StoMre11对StoHerA蛋白生化活性的作用 | 第73-74页 |
| ·底物制备 | 第73页 |
| ·StoMre11对StoHerA ATPase活性的影响 | 第73页 |
| ·StoMre11对StoHerA蛋白解旋酶活性的作用 | 第73-74页 |
| ·结果与讨论 | 第74-80页 |
| ·StoMre11基因的克隆及蛋白的表达和纯化 | 第74-75页 |
| ·StoHerA和StoMre11体外结合实验 | 第75-76页 |
| ·酵母双杂交实验 | 第76-78页 |
| ·载体的构建 | 第76-77页 |
| ·酵母双杂交 | 第77-78页 |
| ·StoHerA和StoMre11功能上的相互作用 | 第78-80页 |
| ·StoMre11能够激活StoHerA蛋白ATPase活性 | 第78-79页 |
| ·StoMre11能够激活StoHerA蛋白解旋酶活性 | 第79-80页 |
| ·小结 | 第80-81页 |
| 第四章 StoHerA在硫磺矿硫化叶菌Sulfolobus solfataricus PH1-16中的表达及其遗传分析 | 第81-110页 |
| ·材料与方法 | 第81-88页 |
| ·菌株及培养 | 第82页 |
| ·质粒构建 | 第82-84页 |
| ·质粒pMZ1-StoHerA和pMZ1-StoHerA(D175A)的构建 | 第82-83页 |
| ·病毒载体pMJ0503-StoHerA(D175A)的构建 | 第83页 |
| ·质粒载体pJ-StoHerA的构建 | 第83-84页 |
| ·硫磺矿硫化叶菌S.solfataricus PH1-16的电转化 | 第84-85页 |
| ·硫磺矿硫化叶菌S.solfataricus PH1-16中蛋白的表达与纯化 | 第85页 |
| ·Western blot检测StoHerA在硫磺矿硫化叶菌S.silfataricus PH1-16中的表达 | 第85页 |
| ·StoHerA和StoMre11蛋白多克隆抗血清的制备 | 第85页 |
| ·Western blot操作方法 | 第85页 |
| ·质谱分析 | 第85-86页 |
| ·双向电泳分析(2-DE) | 第86页 |
| ·表达蛋白的抗原标记(epitope tagging)分析 | 第86-87页 |
| ·pJ-StoHerA转化子的遗传分析 | 第87-88页 |
| ·S.solfataricus PH 1-16及其转化子基因组DNA的提取 | 第87页 |
| ·S.solfataricus PH 1-16及其转化子质粒DNA的提取 | 第87页 |
| ·转化子基因的变化情况 | 第87-88页 |
| ·结果与讨论 | 第88-108页 |
| ·载体的构建 | 第88-91页 |
| ·质粒pMZ1-StoHerA和pMZ1-StoHerA(D175A)的构建 | 第89-90页 |
| ·病毒载体pMJ0503-StoHerA(D175A)的构建 | 第90页 |
| ·质粒载体pJ-StoHerA的构建 | 第90-91页 |
| ·StoHerA在古菌S.solfataricus PH1-16中蛋白的表达与纯化 | 第91-95页 |
| ·利用质粒载体pJ-StoHerA在S.solfataricus PH1-16中表达StoHerA | 第91-93页 |
| ·利用病毒载体pMJ0503-StoHerA(D175A)在S.solftaricus PH1-16表达StoHerA(D175A)蛋白 | 第93-95页 |
| ·双向电泳分析 | 第95-101页 |
| ·利用质粒载体表达StoHerA及其关联蛋白的分析 | 第95-98页 |
| ·利用病毒载体表达StoHerA(D175A)及其关联蛋白的分析 | 第98-101页 |
| ·表达蛋白的抗原标记(epitope tagging)分析 | 第101-103页 |
| ·pJ-StoHerA转化子的遗传分析 | 第103-108页 |
| ·S.solfataricus及其转化子基因组和质粒DNA的提取。 | 第103-104页 |
| ·ST2106基因整合至S.solfataricus基因组中 | 第104-105页 |
| ·阿拉伯糖启动子基因也同ST2106基因一起整合至S.solfataricus基因组中 | 第105-106页 |
| ·RFLP方法分析PCR扩增出的基因为ST2106而非SSO2251 | 第106-107页 |
| ·部分转化子中PyrF基因可能替换了S.solfataricus中基因组转座子插入的PyrF基因或者基因组插入转座子的PyrF基因发生了回复突变 | 第107-108页 |
| ·小结 | 第108-110页 |
| 第五章 结论与展望 | 第110-114页 |
| ·结论 | 第110-111页 |
| ·展望 | 第111-114页 |
| 参考文献 | 第114-130页 |
| 附录 | 第130-146页 |
| 致谢 | 第146-147页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第147-149页 |
| 外文论文 | 第149-185页 |
| Part Ⅰ:Archaeal DNA helicase HerA interacts with Mre11 and unwinds blunt-ended dsDNA and recombination intermediates. | 第150-162页 |
| Part Ⅱ:Expression of the archaeal DNA helicase HerA in Sulfolobus solfataricus and identification of its associated proteins in vivo. | 第162-185页 |
