| 摘要 | 第3-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第1章 引言 | 第12-21页 |
| 1.1 背景 | 第12-15页 |
| 1.1.1 概述 | 第12页 |
| 1.1.2 低分子量肝素的制备方法 | 第12-13页 |
| 1.1.3 肝素酶 | 第13-15页 |
| 1.2 研究进展 | 第15-19页 |
| 1.2.1 定向进化概述 | 第15-16页 |
| 1.2.2 定向进化策略 | 第16-17页 |
| 1.2.2.1 易错PCR | 第16-17页 |
| 1.2.2.2 DNA改组(DNA shuffling) | 第17页 |
| 1.2.3 突变体筛选策略 | 第17-18页 |
| 1.2.4 定向进化的应用 | 第18-19页 |
| 1.3 研究目的及意义 | 第19-20页 |
| 1.4 研究思路 | 第20页 |
| 1.5 研究路线 | 第20-21页 |
| 第2章 通过易错PCR完成肝素酶突变体库的构建 | 第21-38页 |
| 2.1 实验材料 | 第21-23页 |
| 2.1.1 菌种和质粒 | 第21页 |
| 2.1.2 酶与试剂 | 第21-22页 |
| 2.1.3 培养基 | 第22-23页 |
| 2.1.4 主要仪器设备 | 第23页 |
| 2.2 实验方法 | 第23-31页 |
| 2.2.1 菌株的活化与培养 | 第23页 |
| 2.2.2 质粒的提取 | 第23-24页 |
| 2.2.3 引物设计及易错PCR反应体系的确立 | 第24-26页 |
| 2.2.3.1 PCR引物的设计 | 第24-25页 |
| 2.2.3.2 易错PCR反应体系的确立 | 第25-26页 |
| 2.2.3.3 PCR产物的纯化 | 第26页 |
| 2.2.4 重组质粒pET-28a(+)-HpaⅠ的构建 | 第26-28页 |
| 2.2.4.1 表达载体pET-28a(+)与易错PCR纯化产物的双酶切 | 第26-27页 |
| 2.2.4.2 载体pET-28a(+)与目的基因Hpa Ⅰ的连接 | 第27-28页 |
| 2.2.5 重组质粒转化宿主菌 | 第28-29页 |
| 2.2.5.1 Inoue法制备感受态细胞 | 第28-29页 |
| 2.2.5.2 转化 | 第29页 |
| 2.2.6 转化子的鉴定 | 第29-31页 |
| 2.2.6.1 标准PCR鉴定 | 第29-30页 |
| 2.2.6.2 双酶切鉴定 | 第30页 |
| 2.2.6.3 转化子的保存 | 第30-31页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第31-36页 |
| 2.3.1 质粒提取 | 第31页 |
| 2.3.2 易错PCR | 第31-32页 |
| 2.3.4 表达载体pET-28a(+)与易错PCR纯化产物的双酶切 | 第32-33页 |
| 2.3.5 重组质粒pET-28a(+)-Hpa Ⅰ的构建 | 第33-34页 |
| 2.3.6 重组质粒转化宿主菌 | 第34页 |
| 2.3.7 转化子的鉴定 | 第34-36页 |
| 2.3.7.1 标准PCR鉴定 | 第35-36页 |
| 2.3.7.2 双酶切鉴定 | 第36页 |
| 2.4 本章小结 | 第36-38页 |
| 第3章 高通量筛选方法选出高效表达菌株 | 第38-49页 |
| 3.1 实验材料 | 第38-39页 |
| 3.1.1 试剂 | 第38-39页 |
| 3.1.2 主要仪器设备 | 第39页 |
| 3.2 实验方法 | 第39-42页 |
| 3.2.1 菌株的活化 | 第39-40页 |
| 3.2.2 生长曲线的测定 | 第40页 |
| 3.2.3 菌株的培养与诱导 | 第40页 |
| 3.2.4 测酶活的方法--天青A法[60] | 第40-41页 |
| 3.2.5 高通量筛选 | 第41页 |
| 3.2.6 肝素酶标准曲线的制作 | 第41页 |
| 3.2.7 分光光度法测肝素酶的酶活 | 第41-42页 |
| 3.2.8 优化菌株的序列测定 | 第42页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第42-48页 |
| 3.3.1 菌株的活化 | 第42页 |
| 3.3.2 96孔板中重组菌生长曲线的测定 | 第42-43页 |
| 3.3.3 高通量筛选 | 第43-45页 |
| 3.3.4 肝素酶标准曲线的制作 | 第45-46页 |
| 3.3.5 分光光度法测肝素酶的酶活 | 第46页 |
| 3.3.6 优化菌株的序列测定 | 第46-48页 |
| 3.4 本章小结 | 第48-49页 |
| 第4章 肝素酶的纯化及酶学性质研究 | 第49-58页 |
| 4.1 实验材料 | 第49-50页 |
| 4.1.1 菌株 | 第49页 |
| 4.1.2 试剂 | 第49-50页 |
| 4.1.3 仪器 | 第50页 |
| 4.2 实验方法 | 第50-54页 |
| 4.2.1 重组蛋白的大量表达与样品制备 | 第50-51页 |
| 4.2.2 镍柱亲和层析纯化重组蛋白 | 第51页 |
| 4.2.3 镍柱的再生 | 第51页 |
| 4.2.4 重组蛋白酶的酶学性质研究 | 第51-54页 |
| 4.2.4.1 分子量测定 | 第52-53页 |
| 4.2.4.2 肝素酶的最适温度及其热稳定性[61] | 第53页 |
| 4.2.4.3 肝素酶的最适pH及其酸碱稳定性 | 第53页 |
| 4.2.4.4 不同金属离子对肝素酶活性的影响 | 第53-54页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第54-57页 |
| 4.3.1 重组蛋白酶的纯化及分子量测定 | 第54页 |
| 4.3.2 肝素酶的最适温度及其热稳定性 | 第54-55页 |
| 4.3.3 肝素酶的最适pH及其酸碱稳定性 | 第55-56页 |
| 4.3.4 二价阳金属离子对肝素酶活性的影响 | 第56-57页 |
| 4.4 本章小结 | 第57-58页 |
| 第5章 利用高效表达菌株催化肝素制备LMWN | 第58-67页 |
| 5.1 实验材料 | 第58-59页 |
| 5.1.1 菌株 | 第58页 |
| 5.1.2 培养基 | 第58页 |
| 5.1.3 试剂 | 第58-59页 |
| 5.1.4 仪器设备名称及型号 | 第59页 |
| 5.2 实验方法 | 第59-61页 |
| 5.2.1 各种实验条件对重组细胞催化肝素降解反应的影响[63] | 第59-60页 |
| 5.2.1.1 底物浓度的影响 | 第59页 |
| 5.2.1.2 反应温度的影响 | 第59-60页 |
| 5.2.1.3 pH值的影响 | 第60页 |
| 5.2.1.4 转速的影响 | 第60页 |
| 5.2.1.5 细胞密度的影响 | 第60页 |
| 5.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)[64-67] | 第60-61页 |
| 5.2.2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液的配制 | 第60页 |
| 5.2.2.1 PAGE凝胶的制备 | 第60-61页 |
| 5.2.2.3 电泳 | 第61页 |
| 5.2.2.4 染色与脱色 | 第61页 |
| 5.3 实验结果与讨论 | 第61-65页 |
| 5.3.1 各种实验条件对重组细胞催化肝素降解反应的影响 | 第61-64页 |
| 5.3.1.1 底物浓度的影响 | 第61-62页 |
| 5.3.1.2 温度的影响 | 第62页 |
| 5.3.1.3 pH值的影响 | 第62-63页 |
| 5.3.1.4 转速的影响 | 第63页 |
| 5.3.1.5 细胞密度的影响 | 第63-64页 |
| 5.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) | 第64-65页 |
| 5.4 本章小结 | 第65-67页 |
| 第6章 结论 | 第67-70页 |
| 6.1 课题研究成果 | 第67-68页 |
| 6.2 课题创新点 | 第68页 |
| 6.3 课题展望 | 第68-70页 |
| 参考文献 | 第70-74页 |
| 附录 | 第74-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
