| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 前言 | 第11-21页 |
| 1.1 甲基营养菌简介 | 第11-12页 |
| 1.2 3-磷酸甘油酸脱氢酶简介 | 第12-15页 |
| 1.3 ACT功能结构域 | 第15页 |
| 1.4 3-磷酸甘油酸脱氢酶的分子改造 | 第15-16页 |
| 1.5 定点突变 | 第16-18页 |
| 1.6 丙氨酸扫描诱变 | 第18页 |
| 1.7 同源建模 | 第18页 |
| 1.8 L-丝氨酸及其生产应用 | 第18-19页 |
| 1.8.1 L-丝氨酸及其生产方法 | 第18-19页 |
| 1.8.2 利用甲基营养型细菌生产L-丝氨酸 | 第19页 |
| 1.9 实验目的和意义 | 第19-20页 |
| 1.10 技术路线 | 第20-21页 |
| 第二章 材料与方法 | 第21-42页 |
| 2.1 实验材料 | 第21-25页 |
| 2.1.1 实验所用菌株及质粒 | 第21页 |
| 2.1.2 实验所用到的培养基 | 第21-22页 |
| 2.1.3 实验中所用缓冲液及溶液 | 第22-24页 |
| 2.1.4 抗生素 | 第24-25页 |
| 2.1.5 菌株保藏 | 第25页 |
| 2.2 方法与步骤 | 第25-27页 |
| 2.2.1 生物信息学分析预测 | 第25-26页 |
| 2.2.2 M.sp MB200基因组DNA的提取 | 第26-27页 |
| 2.3 serA基因克隆、纯化及酶切 | 第27-29页 |
| 2.3.1 serA基因的PCR扩增 | 第27页 |
| 2.3.2 PCR产物纯化 | 第27-28页 |
| 2.3.3 酶切 | 第28页 |
| 2.3.4 酶切产物纯化 | 第28-29页 |
| 2.4 pET-30a(+)载体的提取、酶切及纯化 | 第29-30页 |
| 2.4.1 pET-30a(+)载体的提取 | 第29-30页 |
| 2.4.2 酶切 | 第30页 |
| 2.4.3 纯化 | 第30页 |
| 2.5 转化 | 第30-32页 |
| 2.5.1 大肠杆菌DH5α化学转化法感受态细胞的制备 | 第30页 |
| 2.5.2 表达载体的构建 | 第30-31页 |
| 2.5.3 转化 | 第31页 |
| 2.5.4 阳性转化子筛选 | 第31-32页 |
| 2.5.5 重组质粒的酶切验证 | 第32页 |
| 2.6 突变体重组菌的构建 | 第32-36页 |
| 2.6.1 反向PCR引物设计 | 第32-33页 |
| 2.6.2 反向PCR扩增与Dpn Ⅰ消化 | 第33-34页 |
| 2.6.3 构建突变转化子 | 第34页 |
| 2.6.4 转化子阳性验证 | 第34页 |
| 2.6.5 突变型重组载体的提取 | 第34-35页 |
| 2.6.6 突变位点测序验证 | 第35页 |
| 2.6.7 表达重组子的构建 | 第35-36页 |
| 2.7 诱导表达检测 | 第36页 |
| 2.8 蛋白酶纯化 | 第36-37页 |
| 2.8.1 粗酶液的制备 | 第36-37页 |
| 2.8.2 纯化 | 第37页 |
| 2.9 变性SDS-PAGE检测 | 第37-38页 |
| 2.9.1 变性SDS-PAGE配方 | 第37页 |
| 2.9.2 制胶以及SDS-PAGE步骤 | 第37-38页 |
| 2.10 NADH标准曲线绘制 | 第38-39页 |
| 2.11 蛋白浓度测定及其蛋白标准曲线绘制 | 第39-40页 |
| 2.12 M.sp MB200中3-PGDH最适条件(温度、pH值)确定 | 第40页 |
| 2.13 3-PGDH的酶活测定及其L-丝氨酸反馈抑制效应分析 | 第40-42页 |
| 第三章 结果与分析 | 第42-56页 |
| 3.1 生物信息学分析 | 第42-47页 |
| 3.1.1 物理化学性质分析 | 第42页 |
| 3.1.2 信号肽预测 | 第42-43页 |
| 3.1.3 亲疏水性分析 | 第43页 |
| 3.1.4 二级结构以及功能域预测分析 | 第43-45页 |
| 3.1.5 多重序列比对 | 第45页 |
| 3.1.6 同源建模 | 第45-47页 |
| 3.2 野生型serA转化子的构建 | 第47-49页 |
| 3.2.1 serA基因的克隆 | 第47-48页 |
| 3.2.2 载体pET30-a(+)质粒的提取和酶切 | 第48页 |
| 3.2.3 野生型重组子构建 | 第48-49页 |
| 3.3 突变型重组子构建 | 第49-53页 |
| 3.3.1 serA基因定点突变 | 第49-51页 |
| 3.3.2 反向PCR产物转化及其PCR验证 | 第51页 |
| 3.3.3 serA基因突变点测序验证 | 第51-53页 |
| 3.4 诱导表达 | 第53页 |
| 3.5 目的蛋白粗酶液经过NTA-镍柱亲和层析纯化 | 第53-54页 |
| 3.6 不同L-丝氨酸浓度下野生型和突变型3-磷酸甘油酸脱氢酶的酶活比较 | 第54-56页 |
| 第四章 讨论与结论 | 第56-59页 |
| 4.1 甲基营养菌MB200 serA基因在大肠杆菌中异源表达 | 第56页 |
| 4.2 3-磷酸甘油酸脱氢酶的分子改造 | 第56-58页 |
| 4.3 结论 | 第58页 |
| 4.4 展望 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 附录一 仪器和设备 | 第68-69页 |
| 附录二 引物序列 | 第69-70页 |
| 附录三 核苷酸序列比对 | 第70-76页 |
| 附录四 氨基酸序列比对 | 第76-78页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第78页 |
