| 论文创新点 | 第12-13页 |
| 摘要 | 第13-15页 |
| Abstract | 第15-16页 |
| 技术路线 | 第17-18页 |
| 第一部分 文献综述 | 第18-47页 |
| 第一章 传染性法氏囊病病毒的研究动态 | 第18-38页 |
| 1 IBDV的病毒学分类地位 | 第18页 |
| 2 IBDV的基因组结构和编码蛋白 | 第18-28页 |
| 2.1 非编码区结构和功能研究 | 第19-20页 |
| 2.2 RNA依赖的RNA聚合酶VP1蛋白 | 第20-22页 |
| 2.3 pVP2、VP2以及4条多肽 | 第22-23页 |
| 2.4 衣壳蛋白VP3 | 第23-25页 |
| 2.5 蛋白酶蛋白VP4 | 第25-26页 |
| 2.6 非结构蛋白VP5 | 第26-28页 |
| 3 病毒蛋白、dsRNA之间的相互关系与病毒粒子的组装 | 第28-30页 |
| 4 IBDV的致病性和毒力差异 | 第30-32页 |
| 5 IBDV和宿主相互作用关系研究 | 第32-35页 |
| 6 IBDV编码蛋白抗原表位研究进展 | 第35-38页 |
| 第二章 病毒蛋白磷酸化的研究进展 | 第38-47页 |
| 1 病毒蛋白磷酸化与病毒的复制 | 第39-42页 |
| 2 病毒蛋白磷酸化与病毒蛋白的位移 | 第42-43页 |
| 3 病毒蛋白磷酸化与病毒的组装 | 第43-44页 |
| 4 病毒蛋白磷酸化与细胞信号通路 | 第44-45页 |
| 5 病毒蛋白磷酸化的其它功能 | 第45-47页 |
| 第二部分 研究内容 | 第47-140页 |
| 第一章 传染性法氏囊病病毒VP4蛋白抗原表位分析 | 第47-72页 |
| 摘要 | 第47-48页 |
| 1 材料 | 第48-49页 |
| 1.1 病毒与细胞 | 第48页 |
| 1.2 试剂与抗体 | 第48-49页 |
| 2 实验方法 | 第49-57页 |
| 2.1 小鼠免疫 | 第49页 |
| 2.2 饲养细胞的准备 | 第49页 |
| 2.3 骨髓瘤细胞制备 | 第49-50页 |
| 2.4 免疫脾细胞制备 | 第50页 |
| 2.5 细胞融合 | 第50页 |
| 2.6 杂交瘤细胞的筛选及克隆化 | 第50-51页 |
| 2.7 单抗腹水的制备 | 第51页 |
| 2.8 单抗腹水ELISA效价的测定 | 第51页 |
| 2.9 IFA鉴定单克隆抗体的反应性以及IFA效价的测定 | 第51-52页 |
| 2.10 单克隆抗体的Ig亚型测定 | 第52页 |
| 2.11 单克隆抗体的Western-blot鉴定 | 第52-53页 |
| 2.11.1 样品准备 | 第52页 |
| 2.11.2 蛋白浓度的测定 | 第52页 |
| 2.11.3 SDS-PAGE及Western-blot | 第52-53页 |
| 2.12 VP4蛋白抗原表位的精细定位 | 第53-57页 |
| 2.12.1 包含抗原表位以及磷酸化修饰的多肽设计与合成 | 第53-55页 |
| 2.12.2 多肽的溶解与保存 | 第55-56页 |
| 2.12.3 多肽与载体蛋白的偶联 | 第56页 |
| 2.12.4 偶联多肽的透析 | 第56-57页 |
| 2.12.5 Peptide-ELISA | 第57页 |
| 2.12.6 Peptide-Dot-ELISA | 第57页 |
| 3 结果与分析 | 第57-68页 |
| 3.1 单抗细胞建株 | 第57-58页 |
| 3.2 单克隆抗体特异性和反应性鉴定 | 第58-61页 |
| 3.3 单抗腹水的ELISA效价、IFA效价及亚型鉴定 | 第61页 |
| 3.4 IBDV VP4蛋白单克隆抗体的抗原表位鉴定 | 第61-65页 |
| 3.5 磷酸化单抗和非磷酸化单抗反应差异性比较 | 第65-67页 |
| 3.6 制备的磷酸化单抗与商业化通用型磷酸化单抗的比较 | 第67页 |
| 3.7 表位的同源性分析 | 第67-68页 |
| 4 讨论 | 第68-72页 |
| 第二章 传染性法氏囊病病毒VP4蛋白磷酸化修饰的细胞内分布与功能分析 | 第72-113页 |
| 摘要 | 第72-73页 |
| 1 材料 | 第73-74页 |
| 1.1 病毒、细胞、载体和抗体 | 第73-74页 |
| 1.2 试剂、材料和仪器 | 第74页 |
| 2 方法 | 第74-86页 |
| 2.1 磷酸化和非磷酸化VP4蛋白在细胞中分布 | 第74-78页 |
| 2.1.1 间接免疫荧光双标检测IBDV感染DF-1细胞中VP4分布 | 第74-75页 |
| 2.1.2 直接免疫荧光双标法检测IBDV感染DF-1细胞VP4分布 | 第75-78页 |
| 2.1.3 IFA检测重组杆状病毒rBV-aVP4、pVP4感染High 5细胞中VP4分布 | 第78页 |
| 2.2 免疫共沉淀 | 第78-79页 |
| 2.3 去磷酸化对VP4蛋白分布的影响 | 第79-82页 |
| 2.3.1 点突变载体构建 | 第79-81页 |
| 2.3.2 带有点突变的超纯质粒抽提 | 第81页 |
| 2.3.3 脂质体介导的转染以及蛋白表达检测 | 第81-82页 |
| 2.4 VP4去磷酸化后多聚蛋白VP243在细胞内的表达 | 第82页 |
| 2.4.1 多聚蛋白VP243重组真核表达载体的构建 | 第82页 |
| 2.4.2 超纯质粒抽提 | 第82页 |
| 2.4.3 质粒转染293T细胞以及样品制备 | 第82页 |
| 2.4.4 SDS-PAGE和Western blot分析 | 第82页 |
| 2.5 VP4蛋白去磷酸化后多聚蛋白VP243体外的转录翻译 | 第82-83页 |
| 2.5.1 超纯质粒抽提 | 第82-83页 |
| 2.5.2 体外转录翻译 | 第83页 |
| 2.5.3 SDS-PAGE和Western blot分析 | 第83页 |
| 2.6 SDS-PAGE以及Western-blot检测杆状病毒表达VP4蛋白 | 第83页 |
| 2.7 细胞蛋白组分的分步抽提以及Western blot分析 | 第83-85页 |
| 2.7.1 细胞蛋白的分步抽提 | 第83-84页 |
| 2.7.2 抽提蛋白的丙酮沉淀 | 第84页 |
| 2.7.3 蛋白浓度的测定 | 第84-85页 |
| 2.7.4 SDS-PAGE以及Western-blot | 第85页 |
| 2.8 荧光定量PCR检测病毒编码蛋白对细胞骨架相关蛋白的影响 | 第85-86页 |
| 2.8.1 引物设计 | 第85页 |
| 2.8.2 超纯质粒抽提 | 第85-86页 |
| 2.8.3 脂质体介导的转染 | 第86页 |
| 2.8.4 细胞总RNA的抽提 | 第86页 |
| 2.8.5 反转录 | 第86页 |
| 2.8.6 Real-time PCR与数据分析 | 第86页 |
| 3 结果与分析 | 第86-106页 |
| 3.1 磷酸化和非磷酸化VP4蛋白在病毒感染细胞中的分布 | 第86-91页 |
| 3.1.1 IBDV感染DF-1细胞中VP4蛋白的分布 | 第86-90页 |
| 3.1.2 杆状病毒表达的VP4蛋白在High5细胞中的分布情况 | 第90-91页 |
| 3.2 点突变真核表达载体构建 | 第91-92页 |
| 3.3 去磷酸化点突变VP4在转染细胞中的表达动态 | 第92-99页 |
| 3.4 VP4多位点去磷酸化后多聚蛋白VP243的表达 | 第99-100页 |
| 3.5 VP4多位点去磷酸化突变的VP243的体外转录翻译 | 第100-102页 |
| 3.6 VP4蛋白的亚细胞分布 | 第102-105页 |
| 3.6.1 磷酸化VP4蛋白在IBDV感染的DF-1细胞中的亚细胞分布 | 第102-103页 |
| 3.6.2 磷酸化VP4蛋白在重组杆状病毒感染的Sf9细胞中的亚细胞分布 | 第103-105页 |
| 3.7 IBDV编码蛋白对细胞骨架相关蛋白的转录本的影响 | 第105-106页 |
| 4 讨论 | 第106-113页 |
| 4.1 IBDV VP4蛋白是一种磷酸化蛋白 | 第107页 |
| 4.2 四个磷酸化位点对VP4蛋白定位和分布的影响 | 第107-108页 |
| 4.3 Tyr99和Thr162位点对VP4蛋白剪切功能的影响 | 第108-110页 |
| 4.4 VP4蛋白主要存在于细胞骨架组分中 | 第110-111页 |
| 4.5 VP4蛋白对细胞骨架相关蛋白转录本的影响 | 第111-113页 |
| 第三章 VP4与IBDV其它编码蛋白的互作研究 | 第113-140页 |
| 摘要 | 第113-115页 |
| 1 材料 | 第115-116页 |
| 1.1 试剂 | 第115页 |
| 1.2 单克隆抗体和多克隆抗体 | 第115页 |
| 1.3 细胞、病毒和载体 | 第115-116页 |
| 2 方法 | 第116-117页 |
| 2.1 转染用超纯质粒抽提 | 第116页 |
| 2.2 脂质体介导的细胞转染 | 第116页 |
| 2.3 间接免疫荧光(IFA) | 第116页 |
| 2.4 免疫荧光双标 | 第116页 |
| 2.5 免疫共沉淀 | 第116-117页 |
| 3 结果与分析 | 第117-137页 |
| 3.1 VP4蛋白与其它IBDV编码蛋白在细胞中的定位关系 | 第117-131页 |
| 3.1.1 VP4与VP1的共定位 | 第117-121页 |
| 3.1.2 VP4与VP2的共定位 | 第121-123页 |
| 3.1.3 VP4与VP3的共定位 | 第123-126页 |
| 3.1.4 VP4与VP5的共定位 | 第126-127页 |
| 3.1.5 VP2与VP3的共定位 | 第127-129页 |
| 3.1.6 VP2、VP3以及VP4的共定位 | 第129-131页 |
| 3.2 免疫共沉淀分析VP4蛋白与VP1、VP3蛋白的关系 | 第131-137页 |
| 3.2.1 病毒感染情况下非磷酸化VP4蛋白与VP1、VP3蛋白的关系 | 第131-133页 |
| 3.2.2 病毒感染情况下pS26-VP4蛋白与VP1、VP3蛋白的关系 | 第133页 |
| 3.2.3 质粒转染情况下VP4蛋白与VP3蛋白的相互关系 | 第133-137页 |
| 4 讨论 | 第137-140页 |
| 全文总结 | 第140-141页 |
| 参考文献 | 第141-160页 |
| 第三部分 附录 | 第160-169页 |
| 附录A 缩略词 | 第160-163页 |
| 附录B 常用缓冲液及培养基配方 | 第163-168页 |
| 附录C 攻博期间发表或录用的学术论文 | 第168-169页 |
| 致谢 | 第169-170页 |
