| 摘要 | 第8-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 英文缩略表(Abbreviations) | 第11-13页 |
| 1 文献综述 | 第13-25页 |
| 1.1 病毒由来 | 第13-15页 |
| 1.1.1 博卡病毒的由来 | 第13页 |
| 1.1.2 博卡病毒的发现 | 第13-15页 |
| 1.2 病原基本特征 | 第15-16页 |
| 1.3 流行病学 | 第16-20页 |
| 1.3.1 分布特点 | 第16-18页 |
| 1.3.2 博卡病毒的年龄分布及流行季节 | 第18-19页 |
| 1.3.3 分子流行病学 | 第19-20页 |
| 1.4 博卡病毒的致病性与致病机理 | 第20-22页 |
| 1.4.1 博卡病毒的致病性 | 第20-21页 |
| 1.4.2 博卡病毒的致病机理 | 第21-22页 |
| 1.5 杆状病毒研究进展 | 第22页 |
| 1.5.1 杆状病毒的发展 | 第22页 |
| 1.6 杆状病毒表达系统的研究 | 第22-25页 |
| 1.6.1 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统概述 | 第22-23页 |
| 1.6.2 Bac-to-Bac表达系统在疫苗研究中的应用 | 第23-24页 |
| 1.6.3 杆状病毒表达系统表达外源蛋白的研究 | 第24-25页 |
| 2 研究目的与意义 | 第25-26页 |
| 3 材料与方法 | 第26-40页 |
| 3.1 实验材料 | 第26-31页 |
| 3.1.1 菌种、细胞及毒株 | 第26页 |
| 3.1.2 载体与质粒 | 第26-28页 |
| 3.1.3 工具酶及主要试剂 | 第28页 |
| 3.1.4 主要培养基的配制 | 第28页 |
| 3.1.5 主要缓冲液 | 第28-30页 |
| 3.1.6 本研究所用PCR引物 | 第30-31页 |
| 3.1.7 试验动物及试验地点 | 第31页 |
| 3.2 实验方法 | 第31-40页 |
| 3.2.1 限制性内切酶酶切反应 | 第31页 |
| 3.2.2 PCR或酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测 | 第31-32页 |
| 3.2.3 PCR或酶切产物的回收与纯化 | 第32页 |
| 3.2.4 外源DNA片段与载体的连接反应 | 第32页 |
| 3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第32页 |
| 3.2.6 连接产物的转化 | 第32-33页 |
| 3.2.7 重组质粒的小量制备(OMEGA质粒小提试剂盒) | 第33页 |
| 3.2.8 重组质粒的大量制备(OMEGA质粒大提试剂盒) | 第33页 |
| 3.2.9 目的蛋白的原核诱导表达 | 第33页 |
| 3.2.10 包涵体提取、纯化与复性 | 第33-34页 |
| 3.2.11 构建重组杆状病毒的操作流程 | 第34-35页 |
| 3.2.12 重组穿梭载体(Bacmid)的构建 | 第35页 |
| 3.2.13 重组穿梭载体(Bacmid)的提取 | 第35页 |
| 3.2.14 重组杆状病毒的获得 | 第35页 |
| 3.2.15 间接免疫荧光试验(IFA)检测目的蛋白的表达 | 第35-36页 |
| 3.2.16 Western blot检测目的蛋白的表达 | 第36页 |
| 3.2.17 病毒粒子的电镜观察 | 第36-37页 |
| 3.2.18 动物试验 | 第37页 |
| 3.2.19 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-α、IFN-β、IFN-γ相对表达水平 | 第37-39页 |
| 3.2.20 统计学方法 | 第39-40页 |
| 4 结果与分析 | 第40-57页 |
| 4.1 PPV4的ORF2基因的截短表达及纯化 | 第40-42页 |
| 4.1.1 pET28a-VP原核表达载体的构建 | 第40页 |
| 4.1.2 VP截短蛋白的原核表达 | 第40-41页 |
| 4.1.3 VP截短蛋白包涵体的复性 | 第41-42页 |
| 4.1.4 间接ELISA确定截短蛋白VP的最佳包被浓度 | 第42页 |
| 4.2 表达PPV4的ORF2的杆状病毒的构建及免疫效力的初步评价 | 第42-57页 |
| 4.2.1 表达PPV4的单拷贝VP2、VP杆状病毒的构建及鉴定 | 第42-48页 |
| 4.2.2. 表达PPV4的多拷贝VP2、VP杆状病毒的构建 | 第48-53页 |
| 4.2.3 表达PPV4的ORF2的杆状病毒的动物试验 | 第53-57页 |
| 4.2.3.1 重组杆状病毒免疫小鼠抗PPV4的ELISA抗体检测 | 第53-54页 |
| 4.2.3.2 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中细胞因子mRNA表达 | 第54-57页 |
| 5 讨论 | 第57-60页 |
| 5.1 PPV4.VP蛋白的原核表达及纯化 | 第57页 |
| 5.2 表达PPV4的ORF2基因的重组杆状病毒的构建及其免疫原性研究 | 第57-60页 |
| 5.2.1 转移载体的构建及蛋白表达 | 第57-58页 |
| 5.2.2 病毒样颗粒VLPs的观察 | 第58页 |
| 5.2.3 重组杆状病毒动物免疫效果的初步评估 | 第58-60页 |
| 6 结论 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-66页 |
| 致谢 | 第66页 |
