| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 综述 | 第11-25页 |
| 1.1 溶菌酶的概述 | 第11-14页 |
| 1.1.1 溶菌酶介绍 | 第11页 |
| 1.1.2 溶菌酶的历史及研究 | 第11页 |
| 1.1.3 溶菌酶的结构 | 第11-12页 |
| 1.1.4 溶菌酶的类型 | 第12页 |
| 1.1.5 溶菌酶的生理学功能 | 第12页 |
| 1.1.6 溶菌酶的催化机制 | 第12-13页 |
| 1.1.7 溶菌酶的应用 | 第13页 |
| 1.1.7.1 溶菌酶在食品中应用 | 第13页 |
| 1.1.7.2 溶菌酶在酶工程上的应用 | 第13页 |
| 1.1.7.3 溶菌酶在医药方面的应用 | 第13页 |
| 1.1.7.4 溶菌酶在农业方面的应用 | 第13页 |
| 1.1.8 溶菌酶在分子生物学中的研究 | 第13-14页 |
| 1.2 枯草芽孢杆菌概述 | 第14-23页 |
| 1.2.1 枯草芽孢杆菌研究背景 | 第14页 |
| 1.2.2 枯草芽孢杆菌表达系统研究进展 | 第14页 |
| 1.2.3 枯草芽孢杆菌表达系统的特点 | 第14-16页 |
| 1.2.3.1 枯草芽孢杆菌表达系统的优点 | 第14-16页 |
| 1.2.3.2 枯草芽孢杆菌表达系统的缺点 | 第16页 |
| 1.2.4 异源蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌途径 | 第16页 |
| 1.2.5 影响外源蛋白在枯草芽孢杆菌中分泌表达因素 | 第16-17页 |
| 1.2.6 提高外源蛋白分泌的途径 | 第17-19页 |
| 1.2.6.1 构建蛋白酶缺陷菌株 | 第17页 |
| 1.2.6.2 采用很少或根本不分泌蛋白酶的芽孢杆菌菌株 | 第17页 |
| 1.2.6.3 控制外源蛋白在对数生长期的分泌 | 第17-18页 |
| 1.2.6.4 采用蛋白酶抑制剂 | 第18页 |
| 1.2.6.5 分子伴侣 | 第18页 |
| 1.2.6.6 与折叠相关的酶的插入 | 第18页 |
| 1.2.6.7 培养基中加入某些离子 | 第18-19页 |
| 1.2.7 枯草芽孢杆菌表达宿主 | 第19页 |
| 1.2.8 枯草芽孢杆的启动子 | 第19-20页 |
| 1.2.9 枯草芽孢杆菌常用载体 | 第20-22页 |
| 1.2.9.1 可复制质粒 | 第20页 |
| 1.2.9.2 噬菌体 | 第20-21页 |
| 1.2.9.3 整合型质粒 | 第21页 |
| 1.2.9.4 芽孢杆菌载体举例 | 第21-22页 |
| 1.2.10 枯草芽孢杆菌常用的转化方法 | 第22-23页 |
| 1.2.10.1 原生质体转化法 | 第22页 |
| 1.2.10.2 碱金属离子转化法 | 第22页 |
| 1.2.10.3 电转化法 | 第22页 |
| 1.2.10.4 化学转化法 | 第22-23页 |
| 1.2.11 芽孢杆菌表达系统几个成功应用实例 | 第23页 |
| 1.2.11.1 中国 | 第23页 |
| 1.2.11.2 日本 | 第23页 |
| 1.2.11.3 加拿大 | 第23页 |
| 1.3 研究内容及意义 | 第23-25页 |
| 第二章 材料与方法 | 第25-39页 |
| 2.1 目的基因SjLys的克隆与序列分析 | 第25-32页 |
| 2.1.1 实验材料与仪器 | 第25-26页 |
| 2.1.1.1 菌株与质粒 | 第25页 |
| 2.1.1.2 主要试剂 | 第25页 |
| 2.1.1.3 常用培养基及配置 | 第25页 |
| 2.1.1.4 常用溶液及缓冲液的配置 | 第25页 |
| 2.1.1.5 主要仪器和设备 | 第25-26页 |
| 2.1.2 方法与步骤 | 第26-32页 |
| 2.1.2.1 引物的设计 | 第26页 |
| 2.1.2.2 目的基因SjLys的扩增 | 第26-27页 |
| 2.1.2.3 低熔点琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物 | 第27-28页 |
| 2.1.2.4 载体pMD18T-Simple与目的片段SjLys的连接及转化 | 第28-29页 |
| 2.1.2.5 重组克隆质粒pMD18T-Simple-SjLys菌落PCR鉴定 | 第29-30页 |
| 2.1.2.6 质粒提取与双酶切鉴定 | 第30-32页 |
| 2.1.2.6.1 质粒提取 | 第30-31页 |
| 2.1.2.6.2 双酶切鉴定 | 第31-32页 |
| 2.1.2.7 重组克隆质粒测序鉴定 | 第32页 |
| 2.2 重组质粒pHT43-SjLys的构建及转化 | 第32-37页 |
| 2.2.1 材料和试剂 | 第32-33页 |
| 2.2.1.1 质粒和菌种 | 第32页 |
| 2.2.1.2 酶和试剂 | 第32-33页 |
| 2.2.2 重组表达载体pHT43-SjLys的构建 | 第33-35页 |
| 2.2.2.1 质粒pHT43和目的片段的酶切与回收 | 第34页 |
| 2.2.2.2 连接与转化 | 第34-35页 |
| 2.2.3 枯草芽孢杆菌WB600化学转化法感受态的制备和转化 | 第35页 |
| 2.2.3.1 化学法转化枯草芽孢杆菌WB600感受态的制备 | 第35页 |
| 2.2.3.2 重组质粒pHT43-SjLys在枯草芽孢杆菌WB600中的化学转化 | 第35页 |
| 2.2.4 枯草芽孢杆菌WB600电转化法感受态的制备和转化 | 第35-36页 |
| 2.2.4.1 电转化法枯草芽孢杆菌WB600感受态的制备 | 第35-36页 |
| 2.2.4.2 重组质粒pHT43-SjLys在枯草芽孢杆菌WB600中的电转化 | 第36页 |
| 2.2.5 对转化的枯草芽孢杆菌阳性克隆进行鉴定 | 第36页 |
| 2.2.6 基因工程菌pHT43-SjLys/WB600的生长曲线测定 | 第36页 |
| 2.2.7 工程菌株pHT43-SjLys/WB600的稳定性分析 | 第36-37页 |
| 2.3 目的基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达研究 | 第37-38页 |
| 2.3.1 蛋白质电泳溶液、凝胶及缓冲液 | 第37页 |
| 2.3.2 SDS-PAGE技术 | 第37-38页 |
| 2.3.3 目的基因SDS-PAGE的分析鉴定 | 第38页 |
| 2.4 重组海参溶菌酶抑菌活性测定 | 第38-39页 |
| 2.4.1 菌种 | 第38页 |
| 2.4.2 抑菌试验 | 第38-39页 |
| 第三章 结果及分析 | 第39-47页 |
| 3.1 海参溶菌酶目的基因SjLys的克隆及分析 | 第39-42页 |
| 3.1.1 目的基因SjLys的扩增 | 第39页 |
| 3.1.2 目的基因SjLys的回收与纯化 | 第39-40页 |
| 3.1.3 重组克隆质粒的菌落PCR验证 | 第40-41页 |
| 3.1.4 重组克隆质粒的双酶切验证 | 第41-42页 |
| 3.2 重组表达质粒pHT43-SjLys的验证及转化 | 第42-44页 |
| 3.2.1 重组表达质粒pHT43-SjLys的双酶切验证 | 第42-43页 |
| 3.2.2 对转化的枯草芽孢杆菌阳性克隆进行鉴定 | 第43-44页 |
| 3.3 工程菌株pHT43-SjLys/WB600的生长曲线测定 | 第44页 |
| 3.4 工程菌株pHT43-SjLys/WB600的稳定性分析 | 第44-45页 |
| 3.5 目的蛋白SDS聚丙烯凝胶电泳分析 | 第45-46页 |
| 3.6 重组蛋白抑菌活性测定 | 第46-47页 |
| 讨论 | 第47-48页 |
| 结论 | 第48-49页 |
| 参考文献 | 第49-54页 |
| 致谢 | 第54-55页 |
| 附录Ⅰ 常用培养基及配置 | 第55-56页 |
| 附录Ⅱ 常用溶液及缓冲液的配置 | 第56-57页 |
| 附录Ⅲ 主要仪器和设备 | 第57-58页 |
| 附录Ⅳ 蛋白质电泳溶液、凝胶及缓冲液 | 第58-59页 |
| 附录Ⅴ | 第59-60页 |
| 附录Ⅵ | 第60页 |
