| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 第一章 绪论 | 第13-25页 |
| 1.1 引言 | 第13页 |
| 1.2 3-HP的合成方法 | 第13-14页 |
| 1.3 合成 3-HP的关键酶简介 | 第14-17页 |
| 1.3.1 甘油脱水酶 | 第14-16页 |
| 1.3.2 醛脱氢酶 | 第16-17页 |
| 1.4 产3-HP基因工程菌的研究进展 | 第17-22页 |
| 1.4.1 以E. coli为宿主合成 3-HP的基因工程菌 | 第18-19页 |
| 1.4.2 以K. pneumoniae为宿主合成 3-HP的基因工程菌 | 第19-21页 |
| 1.4.3 目前面临的问题和研究方向 | 第21-22页 |
| 1.5 基因编辑技术的原理和方法 | 第22-24页 |
| 1.6 选题的依据与研究内容 | 第24-25页 |
| 第二章 3-HP合成关键酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达 | 第25-51页 |
| 2.1 引言 | 第25页 |
| 2.2 材料与方法 | 第25-42页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第25-26页 |
| 2.2.2 培养基 | 第26-27页 |
| 2.2.3 主要工具酶和试剂 | 第27页 |
| 2.2.4 主要实验仪器 | 第27-28页 |
| 2.2.5 实验方法 | 第28-42页 |
| 2.2.5.1 基因组DNA的提取 | 第28页 |
| 2.2.5.2 质粒的提取和目的DNA片段的纯化 | 第28页 |
| 2.2.5.3 大肠杆菌感受态的制备 | 第28-29页 |
| 2.2.5.4 目的DNA片段的转化 | 第29页 |
| 2.2.5.5 甘油脱水酶的表达载体构建 | 第29-34页 |
| 2.2.5.6 醛脱氢酶的表达载体构建 | 第34-35页 |
| 2.2.5.7 甘油脱水酶的酶活检测 | 第35-37页 |
| 2.2.5.8 醛脱氢酶的酶活检测 | 第37-38页 |
| 2.2.5.9 甘油脱水酶和醛脱氢酶的共表达宿主的构建 | 第38页 |
| 2.2.5.10 共表达工程菌摇瓶发酵 | 第38页 |
| 2.2.5.11 代谢产物的分析方法 | 第38-42页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第42-49页 |
| 2.3.1 甘油脱水酶的克隆表达 | 第42-46页 |
| 2.3.1.1 甘油脱水酶不同表达载体的构建 | 第42页 |
| 2.3.1.2 阳性转化子筛选 | 第42-44页 |
| 2.3.1.3 甘油脱水酶SDS-PAGE蛋白表达分析 | 第44-45页 |
| 2.3.1.4 不同表达载体甘油脱水酶活力比较 | 第45-46页 |
| 2.3.2 醛脱氢酶的克隆表达 | 第46-48页 |
| 2.3.2.1 醛脱氢酶表达载体的构建 | 第46页 |
| 2.3.2.2 表达载体阳性克隆筛选 | 第46-47页 |
| 2.3.2.3 醛脱氢酶SDS-PAGE蛋白表达分析 | 第47页 |
| 2.3.2.4 两种表达载体醛脱氢酶活力比较 | 第47-48页 |
| 2.3.3 共表达工程菌摇瓶发酵 | 第48-49页 |
| 2.4 本章小结 | 第49-51页 |
| 第三章 3-HP合成过程中关键代谢途径的改造 | 第51-70页 |
| 3.1 引言 | 第51-52页 |
| 3.2 材料和方法 | 第52-60页 |
| 3.2.1 菌种与质粒 | 第52页 |
| 3.2.2 培养基 | 第52页 |
| 3.2.3 主要工具酶和试剂 | 第52页 |
| 3.2.4 主要实验仪器 | 第52页 |
| 3.2.5 实验方法 | 第52-60页 |
| 3.2.5.1 甘油脱水酶再激活因子gdrB的克隆与表达 | 第52-54页 |
| 3.2.5.2 含甘油脱水酶再激活因子GDRB共表达菌株的构建和摇瓶发酵 | 第54-55页 |
| 3.2.5.3 NAD~+再生基因在工程菌中的表达 | 第55页 |
| 3.2.5.4 乙酰辅酶A合成酶启动子更换 | 第55-60页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第60-68页 |
| 3.3.1 甘油脱水酶再激活因gdrB的克隆与表达 | 第60-63页 |
| 3.3.1.1 含甘油脱水酶再激活因子gdrB的表达载体构建 | 第60页 |
| 3.3.1.2 gdrB阳性转化子的筛选 | 第60-61页 |
| 3.3.1.3 共表达菌株E. coli BL21(DE3)(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pETDuet-dhaB- gdrAB)的摇瓶发酵 | 第61-63页 |
| 3.3.2 NAD~+再生基因对共表达菌株的影响 | 第63-65页 |
| 3.3.2.1 NAD~+再生基因共表达菌株的构建 | 第63页 |
| 3.3.2.2 工程菌株的发酵培养 | 第63-65页 |
| 3.3.3 乙酰CoA合成酶基因acs启动子的更换 | 第65-68页 |
| 3.3.3.1 目标载体pTargetT-N20的构建 | 第65-66页 |
| 3.3.3.2 目的片段donor DNA的构建 | 第66页 |
| 3.3.3.3 乙酰CoA合成酶基因acs启动子替换的阳性转化子筛选 | 第66-67页 |
| 3.3.3.4 乙酰CoA合成酶基因acs启动子的替换对共表达菌株的影响 | 第67-68页 |
| 3.4 本章小结 | 第68-70页 |
| 第四章 重组菌株 3-HP发酵工艺研究 | 第70-79页 |
| 4.1 引言 | 第70页 |
| 4.2 材料与方法 | 第70-74页 |
| 4.2.1 菌种 | 第70页 |
| 4.2.2 培养基 | 第70-71页 |
| 4.2.3 主要实验试剂 | 第71页 |
| 4.2.4 主要实验仪器 | 第71页 |
| 4.2.5 实验方法 | 第71-74页 |
| 4.2.5.1 种子液培养 | 第71页 |
| 4.2.5.2 生物量的测定 | 第71-72页 |
| 4.2.5.3 分析方法 | 第72页 |
| 4.2.5.4 5L发酵罐分批发酵 | 第72页 |
| 4.2.5.5 恒定pH 7.0 对发酵的影响 | 第72-73页 |
| 4.2.5.6 甘油分批补加对发酵的影响 | 第73页 |
| 4.2.5.7 分批补加维生素B12对发酵的影响 | 第73-74页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第74-78页 |
| 4.3.1 5L发酵罐分批发酵 | 第74-75页 |
| 4.3.2 控制发酵液pH 7.0 对发酵产 3-HP的影响 | 第75-76页 |
| 4.3.3 分批补加甘油对发酵产 3-HP的影响 | 第76页 |
| 4.3.4 分批补加辅酶VB12对发酵产 3-HP的影响 | 第76-78页 |
| 4.4 本章小结 | 第78-79页 |
| 第五章 结论与展望 | 第79-82页 |
| 5.1 结论 | 第79-80页 |
| 5.2 展望 | 第80-82页 |
| 参考文献 | 第82-88页 |
| 附录 | 第88-94页 |
| 致谢 | 第94-95页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第95页 |
