| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 1 文献综述 | 第12-19页 |
| 1.1 朵丽蝶兰的简介 | 第12页 |
| 1.2 miR172及其靶基因功能研究现状 | 第12-15页 |
| 1.2.1 MicroRNA (miRNA)的简介 | 第12-13页 |
| 1.2.2 miR172及其靶基因结构 | 第13页 |
| 1.2.3 miR172及其靶基因调控植物花期 | 第13-14页 |
| 1.2.4 miR172及其靶基因调控花器官形成 | 第14页 |
| 1.2.5 miR172及其靶基因调控植物的生长发育 | 第14-15页 |
| 1.3 靶基因预测与鉴定 | 第15-16页 |
| 1.4 RNAi在植物中的研究进展 | 第16-19页 |
| 1.4.1 RNAi的发现 | 第16页 |
| 1.4.2 RNAi的分子机制 | 第16-17页 |
| 1.4.3 RNAi的特点 | 第17页 |
| 1.4.4 RNAi的应用 | 第17-19页 |
| 2 朵丽蝶兰MIR172干涉载体的构建及遗传转化 | 第19-32页 |
| 2.1 试验材料 | 第19-20页 |
| 2.1.1 主要试剂 | 第19页 |
| 2.1.2 主要实验器材 | 第19页 |
| 2.1.3 菌种和载体 | 第19-20页 |
| 2.2 试验方法 | 第20-26页 |
| 2.2.0 RNAi目标区选择及引物设计 | 第20页 |
| 2.2.1 蝴蝶兰MIR172 RNAi片段的扩增 | 第20-21页 |
| 2.2.2 纯化回收PCR产物 | 第21-22页 |
| 2.2.3 连接入门载体 | 第22页 |
| 2.2.4 大肠杆菌的转化 | 第22页 |
| 2.2.5 菌检PCR及菌液测序 | 第22-23页 |
| 2.2.6 LR反应 | 第23-25页 |
| 2.2.6.1 抽取载体与目的载体质粒 | 第23-24页 |
| 2.2.6.2 入门载体与目的载体质粒检测 | 第24页 |
| 2.2.6.3 LR反应 | 第24页 |
| 2.2.6.4 LR反应混合物转化大肠杆菌 | 第24-25页 |
| 2.2.6.5 PCR检测LR反应阳性克隆 | 第25页 |
| 2.2.6.6 表达载体质粒的提取与检测 | 第25页 |
| 2.2.7 表达载体转化农杆菌GV3101 | 第25-26页 |
| 2.2.7.1 农杆菌GV3101感受态的制备 | 第25页 |
| 2.2.7.2 表达载体转化农杆菌GV3101感受态 | 第25-26页 |
| 2.2.7.3 PCR检验 | 第26页 |
| 2.3 农杆菌介导法转化朵丽蝶兰 | 第26-28页 |
| 2.3.1 植物材料 | 第26页 |
| 2.3.2 菌株与质粒 | 第26页 |
| 2.3.3 主要试剂 | 第26页 |
| 2.3.4 主要实验仪器 | 第26-27页 |
| 2.3.5 实验方法 | 第27-28页 |
| 2.3.5.1 培养基的配制 | 第27页 |
| 2.3.5.2 悬浮液的配制 | 第27页 |
| 2.3.5.3 转化菌液的制备 | 第27-28页 |
| 2.3.5.4 预培养 | 第28页 |
| 2.3.5.5 共培养 | 第28页 |
| 2.3.5.6 恢复培养 | 第28页 |
| 2.3.5.7 筛选培养 | 第28页 |
| 2.4 结果与分析 | 第28-31页 |
| 2.4.1 朵丽蝶兰MIR172 RNAi片段的扩增 | 第28-29页 |
| 2.4.2 朵丽蝶兰MIR172 RNAi片段胶回收 | 第29页 |
| 2.4.3 入门载体构建结果 | 第29-30页 |
| 2.4.4 目的载体构建结果 | 第30页 |
| 2.4.5 农杆菌菌检PCR | 第30-31页 |
| 2.5 结果与分析 | 第31-32页 |
| 3 DhMIR172靶基因全长克隆 | 第32-70页 |
| 3.1 实验材料 | 第32页 |
| 3.1.1 植物材料 | 第32页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第32页 |
| 3.1.3 克隆菌株与载体 | 第32页 |
| 3.1.4 主要设备仪器 | 第32页 |
| 3.2 实验方法 | 第32-42页 |
| 3.2.1 特异性引物设计 | 第32-33页 |
| 3.2.2 总RNA提取 | 第33-34页 |
| 3.2.3 3'RACE扩增靶基因3'端序列 | 第34-36页 |
| 3.2.3.1 3'端cDNA第一条链的合成 | 第34-35页 |
| 3.2.3.2 cDNA第一条链的验证 | 第35页 |
| 3.2.3.3 3'RACE扩增 | 第35-36页 |
| 3.2.4 5'RACE扩增靶基因的5'端序列 | 第36-38页 |
| 3.2.4.1 5'端cDNA第一条链的合成 | 第36-37页 |
| 3.2.4.2 cDNA第一条链的验证 | 第37页 |
| 3.2.4.3 5'RACE扩增 | 第37-38页 |
| 3.2.5 PCR产物胶回收 | 第38页 |
| 3.2.6 PCR产物加A尾 | 第38页 |
| 3.2.7 产物连接 | 第38-39页 |
| 3.2.8 转化大肠杆菌 | 第39页 |
| 3.2.9 菌检测序 | 第39页 |
| 3.2.10 靶基因cDNA全长克隆 | 第39-42页 |
| 3.2.10.1 RNA反转录为cDNA | 第39-40页 |
| 3.2.10.2 cDNA验证 | 第40页 |
| 3.2.10.3 靶基因全长克隆 | 第40-41页 |
| 3.2.10.4 PCR产物回收 | 第41页 |
| 3.2.10.5 连接pMD18-T载体 | 第41页 |
| 3.2.10.6 转化大肠杆菌 | 第41页 |
| 3.2.10.7 菌检PCR及测序 | 第41页 |
| 3.2.10.8 靶基因序列分析 | 第41-42页 |
| 3.3 靶基因全长克隆结果与分析 | 第42-61页 |
| 3.3.1 总RNA提取结果 | 第42页 |
| 3.3.2 cDNA检验 | 第42-43页 |
| 3.3.3 3'RACE克隆结果 | 第43页 |
| 3.3.4 5'RACE克隆结果 | 第43-44页 |
| 3.3.5 RNA反转录cDNA验证 | 第44页 |
| 3.3.6 靶基因全长克隆结果 | 第44-47页 |
| 3.3.6.1 DhAP2-1全长克隆结果 | 第44-45页 |
| 3.3.6.2 DhAP2-2和DhAP2-3全长克隆结果 | 第45-47页 |
| 3.3.7 靶基因全长序列分析 | 第47-61页 |
| 3.3.7.1 DhAP2-1序列分析 | 第47-52页 |
| 3.3.7.2 DhAP2-2序列分析 | 第52-56页 |
| 3.3.7.3 DhAP2-3序列分析 | 第56-61页 |
| 3.4 双荧光素酶检测miR172与AP2-1的靶标关系 | 第61-66页 |
| 3.4.1 菌株与质粒 | 第61页 |
| 3.4.2 主要试剂 | 第61页 |
| 3.4.3 主要设备仪器 | 第61-62页 |
| 3.4.4 实验方法 | 第62-66页 |
| 3.4.4.1 目的基因片段的设计与合成 | 第62页 |
| 3.4.4.2 psiCHECK-2-AP2 wt/muta的构建 | 第62-63页 |
| 3.4.4.3 转化大肠杆菌 | 第63页 |
| 3.4.4.4 菌检PCR及测序 | 第63页 |
| 3.4.4.5 psiCHECK-2- AP2 WT/MUTA质粒抽提 | 第63-64页 |
| 3.4.4.6 荧光素酶报告基因检测实验 | 第64-66页 |
| 3.4.4.6.1 共转染步骤 | 第64页 |
| 3.4.4.6.2 检测实验步骤 | 第64-66页 |
| 3.5 朵丽蝶兰DhmiR172及其靶基因定量关系 | 第66-69页 |
| 3.5.1 试验材料 | 第66页 |
| 3.5.2 主要试剂 | 第66-67页 |
| 3.5.4 试验方法 | 第67页 |
| 3.5.4.1 对朵丽蝶兰进行低温处理与采样 | 第67页 |
| 3.5.4.2 提取总RNA | 第67页 |
| 3.5.4.3 RNA反转录为cDNA | 第67页 |
| 3.5.5 定量引物的设计 | 第67页 |
| 3.5.5.1 验证定量引物 | 第67页 |
| 3.5.6 实时荧光定量PCR | 第67-68页 |
| 3.5.7 试验结果与分析 | 第68-69页 |
| 3.5.7.1 定量引物验证结果 | 第68页 |
| 3.5.7.2 朵丽蝶兰DhmiR172及其靶基因低温处理后在茎中的表达 | 第68-69页 |
| 3.6 结果与分析 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-75页 |
| 附录一 | 第75-77页 |
| 个人简介 | 第77-78页 |
| 致谢 | 第78页 |
