| 缩略词表 | 第8-9页 |
| 第一部分 小鼠VEGF/FGF-2疫苗构建与肿瘤干预 | 第9-60页 |
| 摘要 | 第9-11页 |
| ABSTRACT | 第11-14页 |
| 第一章 前言 | 第14-19页 |
| 1.1 VEGF和VEGFR的生物学特点和功能 | 第14页 |
| 1.2 FGF-2的生物学特点和功能 | 第14-15页 |
| 1.3 肿瘤血管生成 | 第15-16页 |
| 1.4 VEGF和FGF-2与肿瘤血管生成 | 第16-17页 |
| 1.5 本课题的研究思路、目的及意义 | 第17-19页 |
| 1.5.1 研究思路 | 第17页 |
| 1.5.2 研究目的 | 第17-18页 |
| 1.5.3 研究意义 | 第18-19页 |
| 第二章 材料与方法 | 第19-38页 |
| 2.1 实验材料 | 第19-20页 |
| 2.1.1 实验质粒、菌株、细胞株 | 第19页 |
| 2.1.2 实验动物 | 第19页 |
| 2.1.3 实验试剂 | 第19-20页 |
| 2.1.3.1 酶及抗体 | 第19页 |
| 2.1.3.2 试剂盒 | 第19-20页 |
| 2.1.3.3 主要试剂及耗材 | 第20页 |
| 2.2 主要仪器设备 | 第20页 |
| 2.3 实验方法 | 第20-38页 |
| 2.3.1 VEGF抗原肽的化学合成 | 第20页 |
| 2.3.2 引物的合成 | 第20-21页 |
| 2.3.3 FGF-2基因序列的设计与合成 | 第21页 |
| 2.3.4 质粒构建 | 第21-27页 |
| 2.3.4.1 VEGF引物退火复性 | 第21-22页 |
| 2.3.4.2 PCR扩增HBcAg、HBcAg-VEGF/FGF-2片段 | 第22页 |
| 2.3.4.3 酶切反应 | 第22-23页 |
| 2.3.4.4 酶切产物回收 | 第23-24页 |
| 2.3.4.5 连接反应 | 第24页 |
| 2.3.4.6 感受细胞的制备 | 第24-25页 |
| 2.3.4.7 转化实验 | 第25页 |
| 2.3.4.8 质粒提取 | 第25-26页 |
| 2.3.4.9 酶切鉴定 | 第26-27页 |
| 2.3.6 重组质粒的诱导表达及可溶性鉴定 | 第27-28页 |
| 2.3.7 病毒样颗粒的纯化 | 第28-29页 |
| 2.3.7.1 硫酸铵盐析法初步纯化重组蛋白 | 第28-29页 |
| 2.3.7.2 蔗糖密度梯度离心进一步纯化重组蛋白 | 第29页 |
| 2.3.8 Sephadex G25脱盐 | 第29-30页 |
| 2.3.9 病毒样颗粒的鉴定 | 第30页 |
| 2.3.9.1 透视电子显微镜观察 | 第30页 |
| 2.3.9.2 高效液相色谱(HPLC)凝胶过滤分析 | 第30页 |
| 2.3.10 包涵体的变性和复性 | 第30页 |
| 2.3.11 蛋白浓度测定 | 第30-31页 |
| 2.3.12 疫苗免疫原性的鉴定 | 第31-32页 |
| 2.3.12.1 小鼠皮下免疫 | 第31页 |
| 2.3.12.2 小鼠腿静脉采血 | 第31页 |
| 2.3.12.3 血清的分离 | 第31页 |
| 2.3.12.4 血清VEGF特异性抗体水平检测 | 第31-32页 |
| 2.3.13 4T1和TC-1肿瘤细胞培养 | 第32-33页 |
| 2.3.14 小鼠预防性免疫实验 | 第33页 |
| 2.3.14.1 皮下免疫 | 第33页 |
| 2.3.14.2 小鼠4T1肿瘤模型的建立 | 第33页 |
| 2.3.15 小鼠治疗性试验 | 第33-34页 |
| 2.3.15.1 小鼠TC-1肿瘤模型的建立 | 第33-34页 |
| 2.3.15.2 治疗性策略对小鼠TC-1模型的干预 | 第34页 |
| 2.3.16 预防性实验效果评价 | 第34-37页 |
| 2.3.16.1 小鼠肿瘤体积测量 | 第34页 |
| 2.3.16.2 小鼠全血血清制备 | 第34页 |
| 2.3.16.3 小鼠灌肺染色 | 第34页 |
| 2.3.16.4 脾细胞的获取 | 第34-35页 |
| 2.3.16.5 ELISPOT实验 | 第35-36页 |
| 2.3.16.6 流式细胞术检测CD8~+IFN-γ~+CTL细胞数目 | 第36-37页 |
| 2.3.17 治疗性实验效果评价 | 第37-38页 |
| 第三章 实验结果 | 第38-54页 |
| 3.1 酶切鉴定重组质粒 | 第38-39页 |
| 3.2 重组蛋白进行诱导表达并鉴定可溶性 | 第39-42页 |
| 3.2.1 重组Q β-VEGF、HBcAg-VEGF的诱导表达和可溶性鉴定 | 第39-40页 |
| 3.2.2 重组HBcAg-FGF-2、Q β-FGF-2的诱导表达和可溶性鉴定 | 第40-42页 |
| 3.3 蛋白纯化 | 第42-45页 |
| 3.3.1 硫酸铵盐析法纯化重组蛋白 | 第42-43页 |
| 3.3.2 蔗糖密度梯度离心进一步纯化目的蛋白 | 第43-45页 |
| 3.4 病毒样颗粒的鉴定 | 第45-47页 |
| 3.4.1 透视电子显微镜观察病毒样颗粒 | 第45-46页 |
| 3.4.2 HPLC分析病毒样颗粒的存在与纯度 | 第46-47页 |
| 3.5 Qβ-VEGF和HBcAg-VEGF的免疫原性 | 第47-48页 |
| 3.6 疫苗免疫对小鼠肿瘤模型的干预 | 第48-54页 |
| 3.6.1 预防性策略对小鼠4T1乳腺肿瘤模型的影响 | 第48-52页 |
| 3.6.1.1 小鼠免疫后特异抗体水平检测 | 第48-49页 |
| 3.6.1.2 疫苗预防性策略对小鼠肿瘤生长的影响 | 第49-50页 |
| 3.6.1.3 预防性策略对小鼠肿瘤肺转移的影响 | 第50-51页 |
| 3.6.1.4 预防性策略对小鼠脾细胞分泌IFN-γ的影响 | 第51-52页 |
| 3.6.2 治疗性策略对小鼠TC-1模型的影响 | 第52-54页 |
| 第四章 讨论 | 第54-57页 |
| 4.1 靶向VEGF和FGF-2的病毒样颗粒疫苗的构建 | 第54页 |
| 4.2 靶向VEGF和FGF-2的疫苗免疫的效果评价 | 第54-55页 |
| 4.3 疫苗免疫抗肿瘤生长的效应机制评价 | 第55-57页 |
| 第五章 结论与展望 | 第57-60页 |
| 5.1 结论 | 第57页 |
| 5.2 展望 | 第57-60页 |
| 第二部分 埃博拉病毒病毒样颗粒的构建 | 第60-76页 |
| 摘要 | 第60-61页 |
| Abstract | 第61-63页 |
| 第一章 前言 | 第63-65页 |
| 1.1 埃博拉病毒的分型与流行现状 | 第63页 |
| 1.2 埃博拉病毒的基因结构与蛋白功能 | 第63-64页 |
| 1.3 埃博拉病毒疫苗研究进展 | 第64-65页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第65-68页 |
| 2.1 实验材料和方法 | 第65页 |
| 2.1.1 菌株、质粒与细胞系 | 第65页 |
| 2.1.2 化学试剂 | 第65页 |
| 2.2 主要仪器 | 第65页 |
| 2.3 常用试剂配制 | 第65页 |
| 2.4 实验方法 | 第65-68页 |
| 2.4.1 GP和VP40基因序列设计与合成 | 第65-66页 |
| 2.4.2 表达GP和VP40的重组质粒构建 | 第66页 |
| 2.4.3 重组质粒转染293FT细胞 | 第66页 |
| 2.4.4 转染的293FT细胞样品处理与电镜观察 | 第66页 |
| 2.4.5 重组蛋白表达的分析鉴定 | 第66-67页 |
| 2.4.6 埃博拉病毒样颗粒感染细胞 | 第67-68页 |
| 第三章 实验结果 | 第68-73页 |
| 3.1 编码GP和VP40蛋白的基因优化 | 第68页 |
| 3.2 重组表达质粒的构建和鉴定 | 第68-70页 |
| 3.2.1 重组表达质粒构建 | 第68-69页 |
| 3.2.2 重组表达质粒鉴定 | 第69-70页 |
| 3.3 表达产物的鉴定 | 第70-71页 |
| 3.4 电镜观察结果 | 第71-72页 |
| 3.5 埃博拉假病毒颗粒感染细胞 | 第72-73页 |
| 第四章 讨论 | 第73-75页 |
| 4.1 病毒样颗粒疫苗的应用潜能 | 第73页 |
| 4.2 埃博拉病毒样颗粒的构建及相关蛋白的检测 | 第73-74页 |
| 4.3 埃博拉病毒样颗粒感染细胞 | 第74-75页 |
| 第五章 结论与展望 | 第75-76页 |
| 5.1 结论 | 第75页 |
| 5.2 展望 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-80页 |
| 附录 | 第80-86页 |
| 附录Ⅰ 主要溶液的配制 | 第80-83页 |
| 附录Ⅱ 主要试剂及耗材 | 第83-84页 |
| 附录Ⅲ 主要仪器 | 第84-86页 |
| 综述 | 第86-92页 |
| 参考文献 | 第90-92页 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 | 第92-93页 |
| 致谢 | 第93页 |
