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D-甘露糖异构酶产生菌的筛选、工程菌的构建及催化性质研究

摘要第3-5页
Abstract第5-6页
第一章 绪论第11-24页
    1.1 营养补充剂第11页
    1.2 D-甘露糖第11-15页
        1.2.1 D-甘露糖的结构、理化性质及安全性第11-12页
        1.2.2 D-甘露糖的代谢途径第12-13页
        1.2.3 D-甘露糖与人类健康第13-14页
        1.2.4 D-甘露糖的来源第14-15页
    1.3 D-甘露糖的化学法合成第15-16页
    1.4 D-甘露糖的生物法制备第16-20页
        1.4.1 D-甘露糖异构酶的微生物来源第16-17页
        1.4.2 D-甘露糖生产相关酶比较第17-19页
        1.4.3 D-甘露糖异构酶的结构及催化机理研究第19页
        1.4.4 酶法生产D-甘露糖研究进展第19-20页
    1.5 枯草芽孢杆菌表达系统第20-21页
        1.5.1 食品级表达系统第20页
        1.5.2 枯草芽孢杆菌表达系统第20页
        1.5.3 Cre-loxP重组酶系统第20-21页
    1.6 本课题的研究意义及主要内容第21-24页
        1.6.1 研究意义第21-22页
        1.6.2 研究内容第22-24页
第二章 产D-甘露糖异构酶菌株Pseudomonas sp. SK27.016的筛选第24-44页
    2.1 前言第24页
    2.2 实验材料与方法第24-30页
        2.2.1 实验试剂第24-25页
        2.2.2 实验仪器与设备第25页
        2.2.3 培养基配方第25页
        2.2.4 样品采集第25-26页
        2.2.5 富集与培养第26页
        2.2.6 菌种筛选第26页
        2.2.7 菌株的 16S rDNA序列分析第26-27页
        2.2.8 构建系统发育树第27页
        2.2.9 D-甘露糖异构酶粗酶液的制备第27页
        2.2.10 酶活力测定第27-28页
        2.2.11 菌株的生理、生化特性鉴定第28页
        2.2.12 产物鉴定第28页
        2.2.13 Pseudomonas sp. SK27.016 MIase的分离纯化第28-29页
        2.2.14 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分析第29-30页
        2.2.15 Pseudomonas sp. SK27.016 MIase酶学性质的研究第30页
    2.3 结果与讨论第30-42页
        2.3.1 菌种的初筛和复筛第30-31页
        2.3.2 菌落培养特征第31-32页
        2.3.3 SK27.01616S rDNA序列测定第32-33页
        2.3.4 LC-MS鉴定及 ~1H-NMR核磁共振图谱第33-35页
        2.3.5 半制备产物的傅里叶红外光谱表征第35-36页
        2.3.6 (NH4)2SO4分级沉淀D-甘露糖异构酶第36-37页
        2.3.7 离子交换层析和疏水柱层析第37-38页
        2.3.8 SDS-PAGE电泳鉴定及纯化结果第38-39页
        2.3.9 Pseudomonas sp. SK27.016 MIase酶学性质研究第39-42页
    2.4 本章小结第42-44页
第三章 D-甘露糖异构酶基因yihS的克隆及其在大肠杆菌中的优化表达第44-57页
    3.1 前言第44-45页
    3.2 材料与方法第45-51页
        3.2.1 菌种与质粒第45页
        3.2.2 工具酶和试剂第45页
        3.2.3 主要仪器第45页
        3.2.4 培养基第45-46页
        3.2.5 D-甘露糖异构酶基因的克隆第46-49页
        3.2.6 D-甘露糖异构酶基因在大肠杆菌中的表达第49-51页
    3.3 结果与讨论第51-56页
        3.3.1 D-甘露糖异构酶基因的扩增第51页
        3.3.2 PCR产物的克隆第51页
        3.3.3 D-甘露糖异构酶基因的测序及序列分析第51-53页
        3.3.4 D-甘露糖异构酶表达质粒的构建第53-54页
        3.3.5 重组菌诱导产物的SDS-PAGE分析第54-55页
        3.3.6 MIase的表达及分离纯化结果第55页
        3.3.7 重组E. coli BL21/pET-28a(+)-yihS MIase催化D-果糖差向异构化反应第55-56页
    3.4 本章小结第56-57页
第四章 D-甘露糖异构酶基因yihS在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵罐补料分批发酵第57-66页
    4.1 前言第57-58页
    4.2 材料与方法第58-60页
        4.2.1 菌种、质粒与发酵培养基第58页
        4.2.2 主要试剂第58页
        4.2.3 主要仪器第58页
        4.2.4 主要实验方法第58-60页
    4.3 结果与讨论第60-65页
        4.3.1 E. coli来源的酶基因yihS克隆第60-61页
        4.3.2 B. subtilis重组工程菌的构建第61页
        4.3.3 D-甘露糖异构酶在重组菌中的表达第61-63页
        4.3.4 B. subtilis WB800/pMA5-yihS的 3.0 L发酵罐补料分批发酵工艺优化第63-65页
    4.4 本章小结第65-66页
第五章 重组D-甘露糖异构酶的分离纯化、酶学性质及酶的应用研究第66-78页
    5.1 前言第66页
    5.2 材料与方法第66-70页
        5.2.1 酶来源及储存方法第66-67页
        5.2.2 主要实验材料第67页
        5.2.3 主要实验仪器第67页
        5.2.4 主要实验方法第67-70页
    5.3 结果与讨论第70-77页
        5.3.1 粗酶粉的获得第70页
        5.3.2 去纯化标签的重组MIase的分离纯化第70页
        5.3.3 重组MIase的分子量测定第70-71页
        5.3.4 等电聚焦电泳第71-72页
        5.3.5 重组MIase的酶学性质第72-77页
    5.4 本章小结第77-78页
第六章 基于Cre/loxP系统的E. coli来源的D-甘露糖异构酶基因的整合型表达第78-89页
    6.1 前言第78-79页
    6.2 材料与方法第79-82页
        6.2.1 菌种和质粒第79页
        6.2.2 培养基第79页
        6.2.3 酶和试剂第79-80页
        6.2.4 主要仪器第80页
        6.2.5 主要实验方法第80-82页
    6.3 结果与讨论第82-88页
        6.3.1 重叠延伸PCR第82-83页
        6.3.2 表达载体pDGI-7S6-P43-yihS的构建第83-84页
        6.3.3 重组菌B. subtilis 1A751/7S6-P43-yihS的构建及筛选第84页
        6.3.4 无抗性基因重组菌B. subtilis 1A751/lox-P43-yihS的构建及筛选第84-85页
        6.3.5 淀粉酶活性初步验证第85-86页
        6.3.6 表达产物的SDS-PAGE分析第86页
        6.3.7 重组菌B. subtilis 1A751/lox-P43-yihS的发酵曲线第86-87页
        6.3.8 重组菌B. subtilis 1A751/lox-P43-yihS的表达稳定性第87-88页
    6.4 本章小结第88-89页
主要结论与展望第89-91页
论文创新点第91-92页
致谢第92-93页
参考文献第93-100页
附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文第100页

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