| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第11-24页 |
| 1.1 营养补充剂 | 第11页 |
| 1.2 D-甘露糖 | 第11-15页 |
| 1.2.1 D-甘露糖的结构、理化性质及安全性 | 第11-12页 |
| 1.2.2 D-甘露糖的代谢途径 | 第12-13页 |
| 1.2.3 D-甘露糖与人类健康 | 第13-14页 |
| 1.2.4 D-甘露糖的来源 | 第14-15页 |
| 1.3 D-甘露糖的化学法合成 | 第15-16页 |
| 1.4 D-甘露糖的生物法制备 | 第16-20页 |
| 1.4.1 D-甘露糖异构酶的微生物来源 | 第16-17页 |
| 1.4.2 D-甘露糖生产相关酶比较 | 第17-19页 |
| 1.4.3 D-甘露糖异构酶的结构及催化机理研究 | 第19页 |
| 1.4.4 酶法生产D-甘露糖研究进展 | 第19-20页 |
| 1.5 枯草芽孢杆菌表达系统 | 第20-21页 |
| 1.5.1 食品级表达系统 | 第20页 |
| 1.5.2 枯草芽孢杆菌表达系统 | 第20页 |
| 1.5.3 Cre-loxP重组酶系统 | 第20-21页 |
| 1.6 本课题的研究意义及主要内容 | 第21-24页 |
| 1.6.1 研究意义 | 第21-22页 |
| 1.6.2 研究内容 | 第22-24页 |
| 第二章 产D-甘露糖异构酶菌株Pseudomonas sp. SK27.016的筛选 | 第24-44页 |
| 2.1 前言 | 第24页 |
| 2.2 实验材料与方法 | 第24-30页 |
| 2.2.1 实验试剂 | 第24-25页 |
| 2.2.2 实验仪器与设备 | 第25页 |
| 2.2.3 培养基配方 | 第25页 |
| 2.2.4 样品采集 | 第25-26页 |
| 2.2.5 富集与培养 | 第26页 |
| 2.2.6 菌种筛选 | 第26页 |
| 2.2.7 菌株的 16S rDNA序列分析 | 第26-27页 |
| 2.2.8 构建系统发育树 | 第27页 |
| 2.2.9 D-甘露糖异构酶粗酶液的制备 | 第27页 |
| 2.2.10 酶活力测定 | 第27-28页 |
| 2.2.11 菌株的生理、生化特性鉴定 | 第28页 |
| 2.2.12 产物鉴定 | 第28页 |
| 2.2.13 Pseudomonas sp. SK27.016 MIase的分离纯化 | 第28-29页 |
| 2.2.14 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分析 | 第29-30页 |
| 2.2.15 Pseudomonas sp. SK27.016 MIase酶学性质的研究 | 第30页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第30-42页 |
| 2.3.1 菌种的初筛和复筛 | 第30-31页 |
| 2.3.2 菌落培养特征 | 第31-32页 |
| 2.3.3 SK27.01616S rDNA序列测定 | 第32-33页 |
| 2.3.4 LC-MS鉴定及 ~1H-NMR核磁共振图谱 | 第33-35页 |
| 2.3.5 半制备产物的傅里叶红外光谱表征 | 第35-36页 |
| 2.3.6 (NH4)2SO4分级沉淀D-甘露糖异构酶 | 第36-37页 |
| 2.3.7 离子交换层析和疏水柱层析 | 第37-38页 |
| 2.3.8 SDS-PAGE电泳鉴定及纯化结果 | 第38-39页 |
| 2.3.9 Pseudomonas sp. SK27.016 MIase酶学性质研究 | 第39-42页 |
| 2.4 本章小结 | 第42-44页 |
| 第三章 D-甘露糖异构酶基因yihS的克隆及其在大肠杆菌中的优化表达 | 第44-57页 |
| 3.1 前言 | 第44-45页 |
| 3.2 材料与方法 | 第45-51页 |
| 3.2.1 菌种与质粒 | 第45页 |
| 3.2.2 工具酶和试剂 | 第45页 |
| 3.2.3 主要仪器 | 第45页 |
| 3.2.4 培养基 | 第45-46页 |
| 3.2.5 D-甘露糖异构酶基因的克隆 | 第46-49页 |
| 3.2.6 D-甘露糖异构酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第49-51页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第51-56页 |
| 3.3.1 D-甘露糖异构酶基因的扩增 | 第51页 |
| 3.3.2 PCR产物的克隆 | 第51页 |
| 3.3.3 D-甘露糖异构酶基因的测序及序列分析 | 第51-53页 |
| 3.3.4 D-甘露糖异构酶表达质粒的构建 | 第53-54页 |
| 3.3.5 重组菌诱导产物的SDS-PAGE分析 | 第54-55页 |
| 3.3.6 MIase的表达及分离纯化结果 | 第55页 |
| 3.3.7 重组E. coli BL21/pET-28a(+)-yihS MIase催化D-果糖差向异构化反应 | 第55-56页 |
| 3.4 本章小结 | 第56-57页 |
| 第四章 D-甘露糖异构酶基因yihS在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵罐补料分批发酵 | 第57-66页 |
| 4.1 前言 | 第57-58页 |
| 4.2 材料与方法 | 第58-60页 |
| 4.2.1 菌种、质粒与发酵培养基 | 第58页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第58页 |
| 4.2.3 主要仪器 | 第58页 |
| 4.2.4 主要实验方法 | 第58-60页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第60-65页 |
| 4.3.1 E. coli来源的酶基因yihS克隆 | 第60-61页 |
| 4.3.2 B. subtilis重组工程菌的构建 | 第61页 |
| 4.3.3 D-甘露糖异构酶在重组菌中的表达 | 第61-63页 |
| 4.3.4 B. subtilis WB800/pMA5-yihS的 3.0 L发酵罐补料分批发酵工艺优化 | 第63-65页 |
| 4.4 本章小结 | 第65-66页 |
| 第五章 重组D-甘露糖异构酶的分离纯化、酶学性质及酶的应用研究 | 第66-78页 |
| 5.1 前言 | 第66页 |
| 5.2 材料与方法 | 第66-70页 |
| 5.2.1 酶来源及储存方法 | 第66-67页 |
| 5.2.2 主要实验材料 | 第67页 |
| 5.2.3 主要实验仪器 | 第67页 |
| 5.2.4 主要实验方法 | 第67-70页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第70-77页 |
| 5.3.1 粗酶粉的获得 | 第70页 |
| 5.3.2 去纯化标签的重组MIase的分离纯化 | 第70页 |
| 5.3.3 重组MIase的分子量测定 | 第70-71页 |
| 5.3.4 等电聚焦电泳 | 第71-72页 |
| 5.3.5 重组MIase的酶学性质 | 第72-77页 |
| 5.4 本章小结 | 第77-78页 |
| 第六章 基于Cre/loxP系统的E. coli来源的D-甘露糖异构酶基因的整合型表达 | 第78-89页 |
| 6.1 前言 | 第78-79页 |
| 6.2 材料与方法 | 第79-82页 |
| 6.2.1 菌种和质粒 | 第79页 |
| 6.2.2 培养基 | 第79页 |
| 6.2.3 酶和试剂 | 第79-80页 |
| 6.2.4 主要仪器 | 第80页 |
| 6.2.5 主要实验方法 | 第80-82页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第82-88页 |
| 6.3.1 重叠延伸PCR | 第82-83页 |
| 6.3.2 表达载体pDGI-7S6-P43-yihS的构建 | 第83-84页 |
| 6.3.3 重组菌B. subtilis 1A751/7S6-P43-yihS的构建及筛选 | 第84页 |
| 6.3.4 无抗性基因重组菌B. subtilis 1A751/lox-P43-yihS的构建及筛选 | 第84-85页 |
| 6.3.5 淀粉酶活性初步验证 | 第85-86页 |
| 6.3.6 表达产物的SDS-PAGE分析 | 第86页 |
| 6.3.7 重组菌B. subtilis 1A751/lox-P43-yihS的发酵曲线 | 第86-87页 |
| 6.3.8 重组菌B. subtilis 1A751/lox-P43-yihS的表达稳定性 | 第87-88页 |
| 6.4 本章小结 | 第88-89页 |
| 主要结论与展望 | 第89-91页 |
| 论文创新点 | 第91-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-100页 |
| 附录： 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第100页 |
