| 中文摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 缩略词表 | 第8-13页 |
| 第一部分 文献综述 | 第13-20页 |
| 第一章 鸭乙型肝炎病毒DNA疫苗的研究进展 | 第13-20页 |
| 1. DNA疫苗的概述 | 第13-14页 |
| 2. DHBV表面抗原DNA疫苗的研究 | 第14-16页 |
| 2.1 表面抗原的功能研究 | 第14-15页 |
| 2.2 表面抗原基因疫苗的研究 | 第15-16页 |
| 3. DHBV核心抗原DNA疫苗的研究 | 第16-17页 |
| 3.1 核心抗原的功能研究 | 第16-17页 |
| 3.2 核心抗原基因疫苗的研究 | 第17页 |
| 4. 融合基因DNA疫苗的研究现状 | 第17-18页 |
| 5. 展望 | 第18-19页 |
| 6. 研究目的及意义 | 第19-20页 |
| 第二部分 试验研究 | 第20-73页 |
| 第二章 鸭乙型肝炎病毒的全基因克隆与序列分析 | 第20-32页 |
| 1. 试验材料 | 第20-21页 |
| 1.1 实验动物、毒株与菌种 | 第20页 |
| 1.2 主要试剂及其配制 | 第20-21页 |
| 1.3 主要仪器 | 第21页 |
| 2. 试验方法 | 第21-26页 |
| 2.1 DNA提取 | 第21页 |
| 2.2 引物设计 | 第21-22页 |
| 2.3 PCR检测 | 第22页 |
| 2.4 DHBV的分离 | 第22页 |
| 2.5 DHBV全长基因的T克隆 | 第22-25页 |
| 2.5.1 PCR扩增与回收 | 第22-23页 |
| 2.5.2 目的基因的连接与转化 | 第23-24页 |
| 2.5.3 菌落PCR鉴定 | 第24-25页 |
| 2.5.4 测序 | 第25页 |
| 2.6 DHBV全长基因的序列分析 | 第25-26页 |
| 3. 结果 | 第26-30页 |
| 3.1 PCR检测血清中DHBV | 第26页 |
| 3.2 DHBV全长基因的扩增、克隆与测序 | 第26-28页 |
| 3.3 DHBV全基因序列分析 | 第28-30页 |
| 3.3.1 基因组结构分析 | 第28页 |
| 3.3.2 核苷酸与氨基酸相似性分析 | 第28-29页 |
| 3.3.3 遗传进化分析 | 第29-30页 |
| 4. 讨论 | 第30-31页 |
| 5. 小结 | 第31-32页 |
| 第三章 DHBV preS基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备 | 第32-49页 |
| 1. 试验材料 | 第32-35页 |
| 1.1 毒株、菌种及实验动物 | 第32页 |
| 1.2 主要试剂及其配制 | 第32-35页 |
| 1.2.1 诱导表达相关试剂的配制 | 第33页 |
| 1.2.2 SDS-PAGE电泳相关溶液的配制 | 第33-34页 |
| 1.2.3 Western blot相关溶液的配制 | 第34页 |
| 1.2.4 蛋白纯化相关溶液的配制 | 第34页 |
| 1.2.5 电洗脱相关溶液的配制 | 第34页 |
| 1.2.6 间接ELISA相关溶液的配制 | 第34-35页 |
| 1.3 主要仪器 | 第35页 |
| 2. 试验方法 | 第35-41页 |
| 2.1 DHBV preS/S基因的生物信息学分析 | 第35页 |
| 2.2 原核表达质粒pET32a(+)-preS的构建 | 第35-37页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第35-36页 |
| 2.2.2 目的基因的PCR扩增与回收 | 第36页 |
| 2.2.3 原核表达质粒的提取 | 第36页 |
| 2.2.4 目的片段的酶切与连接 | 第36-37页 |
| 2.2.5 重组质粒的转化与鉴定 | 第37页 |
| 2.2.6 测序 | 第37页 |
| 2.3 原核表达质粒的诱导表达 | 第37-39页 |
| 2.3.1 原核表达质粒的转化与鉴定 | 第37-38页 |
| 2.3.2 原核表达质粒的诱导表达 | 第38页 |
| 2.3.3 SDS-PAGE分析 | 第38-39页 |
| 2.3.4 Western blot分析 | 第39页 |
| 2.3.5 可溶性分析 | 第39页 |
| 2.4 重组蛋白表达条件的优化 | 第39-40页 |
| 2.4.1 IPTG浓度优化 | 第39页 |
| 2.4.2 诱导时间优化 | 第39-40页 |
| 2.5 重组蛋白的大量诱导表达与纯化 | 第40页 |
| 2.6 蛋白浓度的测定 | 第40页 |
| 2.7 鼠抗-preS高免血清的制备 | 第40-41页 |
| 2.7.1 免疫小鼠 | 第40-41页 |
| 2.7.2 血清效价的测定 | 第41页 |
| 3. 结果 | 第41-47页 |
| 3.1 DHBV preS/S基因序列分析 | 第41-43页 |
| 3.1.1 preS/S蛋白的氨基酸组成分析 | 第41-42页 |
| 3.1.2 preS/S蛋白跨膜区与信号肽预测 | 第42-43页 |
| 3.1.3 preS/S蛋白抗原表位预测 | 第43页 |
| 3.2 DHBV preS基因的扩增 | 第43页 |
| 3.3 重组原核表达质粒的鉴定 | 第43-44页 |
| 3.4 重组preS蛋白的SDS-PAGE分析 | 第44页 |
| 3.5 重组preS蛋白的Western blot分析 | 第44-46页 |
| 3.6 重组preS蛋白的纯化 | 第46-47页 |
| 3.7 鼠抗-preS高免血清的效价检测 | 第47页 |
| 4. 讨论 | 第47-48页 |
| 5. 小结 | 第48-49页 |
| 第四章 DHBV preS/S-C融合基因DNA疫苗的构建及其表达 | 第49-59页 |
| 1. 试验材料 | 第49-50页 |
| 1.1 毒株、菌种与细胞 | 第49页 |
| 1.2 主要试剂及其配制 | 第49-50页 |
| 1.3 主要仪器 | 第50页 |
| 2. 试验方法 | 第50-54页 |
| 2.1 引物设计 | 第50页 |
| 2.2 目的基因的PCR扩增与回收 | 第50-51页 |
| 2.3 目的基因的T克隆 | 第51页 |
| 2.4 pVAX1-preS/S、pVAX1-C和pVAX1-preS/S-C的构建 | 第51-52页 |
| 2.4.1 提取质粒 | 第51页 |
| 2.4.2 酶切与连接 | 第51-52页 |
| 2.4.3 重组质粒的转化与鉴定 | 第52页 |
| 2.5 转染 | 第52-54页 |
| 2.5.1 提取质粒 | 第52页 |
| 2.5.2 COS 7细胞复苏与培养 | 第52-53页 |
| 2.5.3 细胞转染 | 第53-54页 |
| 2.6 Western Blot检测重组质粒的表达产物 | 第54页 |
| 3. 结果 | 第54-57页 |
| 3.1 preS/S、C与preS/S-C基因的PCR扩增 | 第54页 |
| 3.2 T克隆质粒的鉴定 | 第54-55页 |
| 3.3 真核表达质粒的鉴定 | 第55页 |
| 3.4 Western blot检测重组质粒的表达产物 | 第55-57页 |
| 4. 讨论 | 第57-58页 |
| 5. 小结 | 第58-59页 |
| 第五章 DHBV preS/S-C融合基因DNA疫苗的免疫原性研究 | 第59-73页 |
| 1. 试验材料 | 第59-60页 |
| 1.1 实验动物、菌种与血清 | 第59页 |
| 1.2 主要试剂及其配制 | 第59-60页 |
| 1.2.1 包涵体蛋白纯化相关溶液的配制 | 第59-60页 |
| 1.3 主要仪器 | 第60页 |
| 2. 试验方法 | 第60-63页 |
| 2.1 提取质粒 | 第60页 |
| 2.2 免疫动物 | 第60-61页 |
| 2.2.1 免疫动物分组 | 第60-61页 |
| 2.2.2 样品采集 | 第61页 |
| 2.3 纯化抗原 | 第61页 |
| 2.4 抗原浓度测定 | 第61页 |
| 2.5 间接ELISA方法的建立 | 第61-63页 |
| 2.5.1 最佳抗原包被浓度和血清稀释度的选择 | 第61-62页 |
| 2.5.2 最佳酶标抗体工作浓度的测定 | 第62页 |
| 2.5.3 阴阳临界值的确定 | 第62页 |
| 2.5.4 特异性试验 | 第62页 |
| 2.5.5 敏感性试验 | 第62页 |
| 2.5.6 重复性试验 | 第62-63页 |
| 2.6 间接ELISA方法的应用 | 第63页 |
| 3. 结果 | 第63-71页 |
| 3.1 重组C-SN蛋白的SDS-PAGE分析 | 第63-64页 |
| 3.2 间接ELISA的最佳工作条件和判定标准 | 第64-68页 |
| 3.2.1 重组蛋白preS与C-SN的包被浓度与血清稀释度的确定 | 第64-65页 |
| 3.2.2 酶标二抗稀释度的确定 | 第65-66页 |
| 3.2.3 阴、阳性血清临界值的确定 | 第66页 |
| 3.2.4 特异性试验 | 第66-67页 |
| 3.2.5 敏感性试验 | 第67-68页 |
| 3.2.6 重复性试验 | 第68页 |
| 3.3 间接ELISA检测鸭血清中抗preS蛋白的抗体 | 第68-69页 |
| 3.4 间接ELISA检测鸭血清中抗C蛋白的抗体 | 第69-71页 |
| 4. 讨论 | 第71-72页 |
| 5. 小结 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 作者简介 | 第82页 |
| 攻读硕士学位期间完成的学术论文 | 第82页 |
