| 致谢 | 第1-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 专业词汇中英文对照表 | 第10-16页 |
| 第一章 绪论 | 第16-40页 |
| ·定量蛋白质组学概况 | 第16-17页 |
| ·基于抗体的定量蛋白质组学技术 | 第16页 |
| ·基于质谱的定量蛋白质组学技术 | 第16-17页 |
| ·多反应监测技术(MRM) | 第17-29页 |
| ·MRM技术的原理及特点 | 第17-19页 |
| ·MRM定量的常见实验应用与策略 | 第19页 |
| ·MRM的技术要点及难点 | 第19-22页 |
| ·母子离子对的初步选择 | 第19-20页 |
| ·靶向蛋白质组分离技术的特点 | 第20-21页 |
| ·MRM实验条件的优化 | 第21-22页 |
| ·常见用于MRM的稳定同位素标记策略技术 | 第22-25页 |
| ·mTRAQ稳定同位素标记试剂在MRM技术中的应用 | 第25-28页 |
| ·MRM技术的多样化发展 | 第28-29页 |
| ·醛酮还原酶(AKR)家族 | 第29-37页 |
| ·AKR的定义和分类 | 第30-31页 |
| ·人源AKR成员构成 | 第31-32页 |
| ·AKR蛋白的晶体结构 | 第32-33页 |
| ·醛酮还原反应的催化机制 | 第33页 |
| ·底物特异性 | 第33-34页 |
| ·人源AKR蛋白的组织特异性 | 第34页 |
| ·人源AKR蛋白的异常表达与肿瘤 | 第34-35页 |
| ·AKR成员的功能及其代偿现象 | 第35-36页 |
| ·AKR与氧化应力 | 第36-37页 |
| ·问题与小结 | 第37-40页 |
| 第二章 人源AKR蛋白MTRAQ/MRM绝对定量策略建立 | 第40-70页 |
| ·前言 | 第40-41页 |
| ·材料与方法 | 第41-52页 |
| ·实验材料 | 第41-44页 |
| ·肿瘤细胞系 | 第41页 |
| ·主要试剂 | 第41-44页 |
| ·质粒与菌种 | 第41-42页 |
| ·酶类 | 第42页 |
| ·生化试剂 | 第42-43页 |
| ·引物 | 第43页 |
| ·主要仪器设备 | 第43-44页 |
| ·主要分析软件 | 第44页 |
| ·实验方法 | 第44-52页 |
| ·目的基因的克隆 | 第44-45页 |
| ·质粒构建 | 第45页 |
| ·DNA的回收与纯化 | 第45页 |
| ·目的基因的定向克隆与鉴定 | 第45-46页 |
| ·质粒提取 | 第46-47页 |
| ·细菌的转化 | 第47页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第47页 |
| ·重组蛋白质的纯化 | 第47-48页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第48页 |
| ·Western blot | 第48-49页 |
| ·蛋白质的浓度测定 | 第49页 |
| ·样品胶内消化 | 第49-50页 |
| ·样品液体消化 | 第50页 |
| ·mTRAQ标记样品 | 第50-51页 |
| ·质谱上样 | 第51页 |
| ·LC-MS/MS质谱测定 | 第51-52页 |
| ·质谱数据的处理及数据库搜索 | 第52页 |
| ·实验结果 | 第52-70页 |
| ·人源AKR成员的序列比对 | 第52-55页 |
| ·人源AKR蛋白的质粒构建 | 第55-56页 |
| ·人源AKR蛋白特异肽段的最终筛选及合成 | 第56-57页 |
| ·mTRAQ稳定同位素试剂肽段标记效率 | 第57-58页 |
| ·mTRAQ标记后肽段母子离子对的筛选及其质谱参数的优化 | 第58-60页 |
| ·细胞样品预分离方法的选择 | 第60-64页 |
| ·细胞裂解蛋白质的SDS-PAGE分离 | 第60-61页 |
| ·用SDS-PAGE方法进行蛋白预分离的效果对比 | 第61-63页 |
| ·用SDS-PAGE方法进行蛋白预分离的重复性验证 | 第63-64页 |
| ·基于样品背景下标准曲线的建立 | 第64-69页 |
| ·基于样品背景下色谱条件的优化 | 第65-66页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第66-67页 |
| ·数据采集的质控标准 | 第66页 |
| ·各个母子离子对标准曲线的绘制 | 第66-67页 |
| ·复合背景及单一背景下标准曲线的比较 | 第67-69页 |
| ·复合背景及单一背景下标准曲线的相关性分析 | 第67-68页 |
| ·复合背景及单一背景下标准曲线的对比 | 第68-69页 |
| ·小结 | 第69-70页 |
| 第三章 不同肿瘤细胞中AKR蛋白表达水平的测定 | 第70-82页 |
| ·前言 | 第70页 |
| ·材料与方法 | 第70-71页 |
| ·主要试剂 | 第70-71页 |
| ·主要仪器设备 | 第71页 |
| ·实验方法 | 第71页 |
| ·结果与讨论 | 第71-82页 |
| ·MRM定量数据质量的评估 | 第71页 |
| ·7个肿瘤细胞系中人源AKR蛋白表达水平的绝对定量结果 | 第71-74页 |
| ·基于一个肽段或两个肽段对同一蛋白绝对定量结果比较 | 第74-77页 |
| ·两两蛋白间基于一个肽段或两个肽段的绝对定量比较 | 第74-76页 |
| ·比较以每个蛋白2个肽段为绝对定量基础的ARK蛋白表达水平的聚类结果 | 第76-77页 |
| ·不同肿瘤细胞中ARK蛋白表达水平的聚类分析 | 第77-78页 |
| ·不同类型肿瘤细胞系中人源AKR蛋白的绝对定量分析 | 第78-80页 |
| ·不同肿瘤细胞中同种人源ARK蛋白的表达水平比较 | 第78-79页 |
| ·同种肿瘤细胞中不同AKR蛋白的表达水平比较 | 第79-80页 |
| ·小结 | 第80-82页 |
| 第四章 利用MRM技术对AKR1C1蛋白半胱氨酸修饰的检测及该修饰对酶活的影响 | 第82-98页 |
| ·前言 | 第82页 |
| ·材料和方法 | 第82-86页 |
| ·实验材料(部分同第二章) | 第82-83页 |
| ·主要试剂 | 第82-83页 |
| ·主要分析软件 | 第83页 |
| ·PCR引物 | 第83页 |
| ·主要仪器设备 | 第83页 |
| ·实验方法 | 第83-86页 |
| ·样品鉴定前处理 | 第83页 |
| ·位点突变PCR反应 | 第83-84页 |
| ·酶学活性测定 | 第84页 |
| ·细胞氧化应力下培养及细胞内ROS的测定 | 第84页 |
| ·MALDI-TOF/TOF质谱鉴定 | 第84-85页 |
| ·LC-MS/MS质谱鉴定 | 第85-86页 |
| ·实验结果 | 第86-98页 |
| ·AKR1C1和AKR1C2蛋白的生物信息学对比分析 | 第86-87页 |
| ·通过MRM检测氧化应力下AKR1C1蛋白C87体内氧化状态的变化 | 第87-90页 |
| ·氧化应力下Huh7细胞的培养与检测 | 第88页 |
| ·MRM方法检测体内AKR1C1的活性位点修饰水平 | 第88-90页 |
| ·定量检测半胱氨酸还原态的样品处理过程 | 第89-90页 |
| ·为定量检测半胱氨酸还原态的MRM方法建立 | 第90页 |
| ·氧化状态下AKR1C1和AKR1C2的酶活对比 | 第90-92页 |
| ·AKR1C1在氧化状态下影响活性变化的位点研究 | 第92-96页 |
| ·AKR1C1在氧化状态下影响活性变化位点的质谱鉴定 | 第92-94页 |
| ·通过MALDI-TOF-TOF对AKR1C1 Cys87进行修饰状态的检测 | 第92-94页 |
| ·通过ESI-QTOF对AKR1C1 Cys87进行修饰状态的检测 | 第94页 |
| ·AKR1C1半胱氨酸位点突变蛋白的活性测定 | 第94-96页 |
| ·小结 | 第96-98页 |
| 第五章 讨论 | 第98-104页 |
| ·对高同源性家族蛋白进行MRM定量前的样品制备 | 第98-100页 |
| ·基于MTRAQ三标方法建立的绝对定量策略的讨论 | 第100-101页 |
| ·用一个或多个肽段作为同一蛋白MRM定量基础的探讨 | 第101-104页 |
| 基本结论 | 第104-106页 |
| 参考文献 | 第106-116页 |
| 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第116页 |
