| 摘要 | 第1-21页 |
| Abstract | 第21-29页 |
| 符号说明及缩写词 | 第29-30页 |
| 第一章 绪论 | 第30-48页 |
| ·嗜热链球菌的进化地位 | 第30-32页 |
| ·嗜热链球菌代谢特征 | 第32-34页 |
| ·碳代谢 | 第32-33页 |
| ·氮代谢 | 第33-34页 |
| ·嗜热链球菌代谢调控 | 第34-41页 |
| ·嗜热链球菌碳代谢调控机制 | 第35页 |
| ·嗜热链球菌全局转录调控因子CodY的调控机制 | 第35-41页 |
| ·全局转录调控因子CodY的结构基础 | 第36-37页 |
| ·CodY调控模式 | 第37-39页 |
| ·CodY在革兰氏阳性菌内的调控网络 | 第39-41页 |
| ·嗜热链球菌应对环境胁迫的策略 | 第41-45页 |
| ·嗜热链球菌抗氧胁迫机制 | 第42页 |
| ·嗜热链球菌抗热胁迫机制 | 第42-43页 |
| ·嗜热链球菌对外源DNA入侵的应对机制 | 第43-45页 |
| ·本论文的研究思路及内容 | 第45-48页 |
| 第二章 嗜热链球菌全局转录调控因子CodY的调控网络 | 第48-70页 |
| ·材料 | 第48-50页 |
| ·菌株和质粒 | 第48-49页 |
| ·培养基 | 第49-50页 |
| ·方法 | 第50-53页 |
| ·嗜热链球菌转录调控因子codY基因的敲除 | 第50-51页 |
| ·codY基因敲除载体的构建 | 第50页 |
| ·codY基因敲除及验证 | 第50-51页 |
| ·codY基因的过表达回补 | 第51页 |
| ·野生菌株ST2017及突变株ST2017△codY的生物学特性分析 | 第51-52页 |
| ·生长曲线测定 | 第51页 |
| ·代谢产物检测 | 第51-52页 |
| ·S.thermophilus ST2017和ST2017△codY转录组测序 | 第52-53页 |
| ·转录组测序样品制备 | 第52页 |
| ·转录组测序的建库、测序和数据分析 | 第52-53页 |
| ·实时荧光定量PCR验证 | 第53页 |
| ·结果 | 第53-67页 |
| ·S.thermophilus ST2017转录调控因子codY突变株的构建 | 第53-54页 |
| ·S.thermophilus ST2017和ST2017△codY的生长差异 | 第54-55页 |
| ·S.thermophilus ST2017和ST2017△codY利用半乳糖的差异 | 第55-56页 |
| ·S.thermophilus ST2017和ST2017△codY乳酸产生量的差异 | 第56页 |
| ·S thermophilus ST2017和ST2017△codY的转录组学分析 | 第56-67页 |
| ·RNA质量检测 | 第56-57页 |
| ·转录组学数据评价 | 第57-59页 |
| ·CodY在嗜热链球菌中的转录调控网络 | 第59-64页 |
| ·RT-qPCR验证 | 第64-65页 |
| ·S. thermophilus ST2017和ST2017△codY差异表达基因聚类 | 第65-66页 |
| ·嗜热链球菌转录调控因子CodY的碳、氮代谢调控图 | 第66-67页 |
| ·讨论 | 第67-70页 |
| 第三章 嗜热链球菌转录调控因子CodY的作用机制 | 第70-90页 |
| ·材料 | 第71-72页 |
| ·菌株和质粒 | 第71-72页 |
| ·实验试剂和仪器 | 第72页 |
| ·方法 | 第72-75页 |
| ·CodY大肠杆菌表达载体的构建、表达和纯化 | 第72-74页 |
| ·EMSA实验 | 第74页 |
| ·ITC实验 | 第74-75页 |
| ·结果 | 第75-86页 |
| ·S. thermophilus ST2017转录调控因子CodY的转录情况 | 第75-77页 |
| ·CodY基因在不同生长期的转录水平 | 第75页 |
| ·营养组分对codY基因的转录影响 | 第75-77页 |
| ·CodY蛋白和启动子的体外结合实验 | 第77-80页 |
| ·CodY蛋白的表达与纯化 | 第77-79页 |
| ·EMSA检测CodY和启动子的作用 | 第79页 |
| ·分支氨基酸在CodY蛋白和启动子体外结合中的作用 | 第79-80页 |
| ·GTP在CodY和启动子体外结合中的作用 | 第80页 |
| ·胞内检测BCAA对CodY转录调控的激活作用 | 第80-81页 |
| ·S. thermophilus ST2017转录调控因子CodY结合域的功能验证 | 第81-86页 |
| ·S. thermophilus ST2017 CodY结合位点预测 | 第81-84页 |
| ·CodY结合位点的功能验证 | 第84-86页 |
| ·讨论 | 第86-90页 |
| 第四章 嗜热链球菌转录调控因子CodY在碳、氮代谢调控中的作用 | 第90-106页 |
| ·材料 | 第90-91页 |
| ·菌株和质粒 | 第90-91页 |
| ·实验试剂 | 第91页 |
| ·培养基 | 第91页 |
| ·方法 | 第91-95页 |
| ·S.thermophilus ST2017和ST2017△codY在CDM培养基中的生长曲线 | 第91-92页 |
| ·谷氨酸脱氢酶在菌株ST2017和ST2017△codY的差异表达 | 第92页 |
| ·绿色荧光蛋白为报告基因原位检测谷氨酸脱氢酶启动子的转录 | 第92页 |
| ·荧光强度测定 | 第92-93页 |
| ·EMSA检测CodY和谷氨酸脱氢酶启动子的作用 | 第93页 |
| ·谷氨酸脱氢酶酶活测定 | 第93-94页 |
| ·谷氨酸脱氢酶Km值测定 | 第94页 |
| ·谷氨酸脱氢酶突变株的构建 | 第94-95页 |
| ·插入失活载体的构建 | 第94页 |
| ·谷氨酸脱氢酶基因的插入失活 | 第94-95页 |
| ·结果 | 第95-104页 |
| ·依赖转录调控因子CodY的生长差异 | 第95-96页 |
| ·谷氨酸脱氢酶在嗜热链球菌碳代谢和氮代谢转化中的作用 | 第96-97页 |
| ·CodY对谷氨酸脱氢酶基因gdhA转录的调控作用 | 第97-100页 |
| ·RT-qPCR检测CodY对gdhA转录的抑制作用 | 第97页 |
| ·CodY对谷氨酸脱氢酶基因gdhA转录的调控作用 | 第97-98页 |
| ·CodY对谷氨酸脱氢酶氨基酸依赖的转录抑制 | 第98-99页 |
| ·CodY对gdhA基因调控的体外验证 | 第99-100页 |
| ·嗜热链球菌谷氨酸脱氢酶在碳代谢和氮代谢转化中的作用 | 第100-104页 |
| ·嗜热链球菌谷氨酸脱氢酶控制的可逆反应 | 第100页 |
| ·氮源限制条件下碳源向氮源的转化 | 第100-102页 |
| ·碳源限制条件下氮源向碳源的转化 | 第102-103页 |
| ·谷氨酸脱氢酶在嗜热链球菌适应牛奶环境中的作用 | 第103-104页 |
| ·讨论 | 第104-106页 |
| 第五章 转录调控因子CodY对嗜热链球菌抗逆性的调控 | 第106-126页 |
| ·材料 | 第107页 |
| ·菌株和质粒 | 第107页 |
| ·方法 | 第107-111页 |
| ·二组分系统TCS01过表达菌株的构建 | 第107-108页 |
| ·二组分系统TCS01插入失活突变株的构建 | 第108页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第108-109页 |
| ·EMSA实验步骤 | 第109-110页 |
| ·S.thermophilus ST2017和ST2017△codY的存活率检测 | 第110页 |
| ·高温胁迫处理 | 第110页 |
| ·过氧化氢胁迫处理 | 第110-111页 |
| ·谷胱甘肽浓度测定 | 第111页 |
| ·结果 | 第111-123页 |
| ·转录调控因子CodY和二组分系统TCS01的交互调控网络 | 第111-114页 |
| ·转录调控因子CodY对二组分系统TCS01的转录抑制 | 第112页 |
| ·EMSA检测CodY蛋白和TCS01启动子的相互作用 | 第112-113页 |
| ·转录调控因子CodY和二组分系统TCS01的调控网络 | 第113-114页 |
| ·转录调控因子CodY对氧胁迫应答的调控 | 第114-117页 |
| ·野生菌株和codY突变株对氧胁迫的耐受性差异 | 第114页 |
| ·谷胱甘肽合成酶在抗氧胁迫中的作用 | 第114-116页 |
| ·转录调控因子Rr01、CodY对谷胱甘肽合成酶基因的转录调控 | 第116-117页 |
| ·转录调控因子Rr01、CodY和STND_1346启动子的体外结合实验 | 第117页 |
| ·转录调控因子CodY对乳酸胁迫应答的调控 | 第117-118页 |
| ·转录调控因子CodY对高温胁迫应答的调控 | 第118-121页 |
| ·codY缺失提高菌体高温胁迫的耐受性 | 第118-120页 |
| ·热休克蛋白DnaK和GroESL的上调表达提高菌体耐热性 | 第120页 |
| ·CodY和dnaK和groESL启动子的体外结合实验 | 第120-121页 |
| ·嗜热链球菌转录调控因子CodY对渗透压胁迫应答调控 | 第121-123页 |
| ·嗜热链球菌codY的敲除提高菌体在高渗环境中的存活性 | 第121-122页 |
| ·CodY对STND_0113和STND_0135的转录调控 | 第122页 |
| ·CodY和STND_0113和STND_0135启动子的体外结合实验 | 第122-123页 |
| ·讨论 | 第123-126页 |
| 第六章 嗜热链球菌转录调控因子CodY对CRISPR-Cas系统的调控作用 | 第126-140页 |
| ·材料 | 第126-127页 |
| ·方法 | 第127-130页 |
| ·S.thermophilus ST2017中Cas5过表达质粒构建 | 第127-128页 |
| ·Cas5蛋白及突变体的蛋白表达载体构建 | 第128-129页 |
| ·Cas5蛋白及突变体蛋白的表达纯化 | 第129-130页 |
| ·S thermophilus ST2017 CRISPR1/Cas5基因对质粒稳定性测定 | 第130页 |
| ·噬菌体感染效率测定 | 第130页 |
| ·抗噬菌体菌株筛选 | 第130页 |
| ·结果 | 第130-138页 |
| ·Cas5基因对质粒稳定性影响 | 第130-131页 |
| ·Cas5基因对噬菌体抗性影响 | 第131页 |
| ·Cas5依赖的外源DNA抗性机制 | 第131-136页 |
| ·不依赖于新Spacer插入的质粒丢失和噬菌体抗性 | 第131-134页 |
| ·不依赖于crRNA的核酸酶活性 | 第134-135页 |
| ·Ruv和HNH结构域的功能 | 第135页 |
| ·Cas5蛋白对基因组DNA无切割作用 | 第135-136页 |
| ·S.thermophilus ST2017转录调控因子CodY对CRISPR1/Cas系统的调控 | 第136-138页 |
| ·转录调控因子CodY对cas5基因的转录抑制作用 | 第136-137页 |
| ·二组分系统TCS01对cas5的转录抑制 | 第137-138页 |
| ·讨论 | 第138-140页 |
| 第七章 基于丙氨酸消旋酶食品级表达载体的构建及应用 | 第140-155页 |
| ·材料 | 第140-143页 |
| ·菌株和质粒 | 第140-142页 |
| ·实验试剂和培养基 | 第142-143页 |
| ·方法 | 第143-147页 |
| ·诱导型食品级表达载体的构建及应用 | 第143-145页 |
| ·L.lactis NZ900丙氨酸消旋酶基因(alr)敲除载体的构建 | 第143页 |
| ·Alr基因的敲除 | 第143-144页 |
| ·基于丙氨酸消旋酶基因的过表达载体的构建 | 第144页 |
| ·绿色荧光蛋白和猪圆环病毒衣壳蛋白的表达 | 第144-145页 |
| ·组成型食品级表达体系的构建及应用 | 第145-147页 |
| ·干酪乳杆菌alr基因敲除载体构建 | 第145页 |
| ·干酪乳杆菌氨酸消旋酶基因的敲除 | 第145页 |
| ·组成型食品级表达载体的构建 | 第145-146页 |
| ·S.aureus NucB和E.coli K88ac FaeG的组成型表达 | 第146页 |
| ·Western Blot检测鞭毛蛋白FaeG的分泌表达 | 第146-147页 |
| ·结果 | 第147-153页 |
| ·诱导型食品级表达载体的构建和应用 | 第147-150页 |
| ·L.lactis丙氨酸消旋酶基因缺失株的构建 | 第147页 |
| ·绿色荧光蛋白和猪圆环病毒衣壳蛋白过表达载体构建示意图 | 第147-148页 |
| ·食品级表达系统可行性检测 | 第148-149页 |
| ·猪圆环病毒衣壳蛋白的分泌表达 | 第149-150页 |
| ·组成型食品级表达体系的构建及应用 | 第150-153页 |
| ·组成型食品级表达体系的构建 | 第150-152页 |
| ·组成型食品级表达载体NucB的分泌表达 | 第152页 |
| ·鞭毛蛋白FaeG的分泌表达 | 第152-153页 |
| ·讨论 | 第153-155页 |
| 结论与展望 | 第155-158页 |
| 参考文献 | 第158-168页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第168-169页 |
| 致谢 | 第169-170页 |
| 外文写作 | 第170-192页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第192页 |
