| 摘要 | 第1-12页 |
| ABSTRACT | 第12-14页 |
| 缩略语表 | 第14-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-40页 |
| ·衣藻的生物学特征 | 第16-22页 |
| ·衣藻的分类地位及其细胞结构 | 第16-17页 |
| ·衣藻的生活史 | 第17-18页 |
| ·衣藻的无性生殖 | 第17-18页 |
| ·衣藻的有性生殖 | 第18页 |
| ·衣藻具有三套相对独立的遗传系统 | 第18-20页 |
| ·衣藻是一种模式生物 | 第20-22页 |
| ·衣藻遗传转化进展 | 第22-25页 |
| ·衣藻的核基因组转化 | 第22-23页 |
| ·衣藻的叶绿体转化 | 第23-25页 |
| ·衣藻叶绿体蛋白表达调控 | 第25-26页 |
| ·衣藻是潜在的外源蛋白表达宿主 | 第26-33页 |
| ·常见的外源蛋白表达宿主 | 第26-27页 |
| ·转基因植物表达系统 | 第27-28页 |
| ·外源蛋白在衣藻叶绿体中的表达 | 第28-33页 |
| ·衣藻叶绿体表达系统的优势 | 第28-30页 |
| ·增强衣藻叶绿体中重组蛋白表达水平的方法 | 第30-31页 |
| ·在衣藻叶绿体中表达外源蛋白的研究进展 | 第31-33页 |
| ·口服疫苗研究进展 | 第33-38页 |
| ·口服疫苗的粘膜免疫机制 | 第33-35页 |
| ·转基因植物口服疫苗 | 第35-37页 |
| ·口服疫苗佐剂 | 第37-38页 |
| ·生物安全性问题 | 第38页 |
| ·本课题研究的目的和意义 | 第38-40页 |
| 第二章 衣藻叶绿体表达载体的构建 | 第40-60页 |
| ·实验材料 | 第41-43页 |
| ·主要实验仪器 | 第41页 |
| ·菌株和质粒 | 第41页 |
| ·酶与主要试剂 | 第41-42页 |
| ·培养基 | 第42页 |
| ·PCR引物 | 第42-43页 |
| ·实验方法 | 第43-55页 |
| ·CACL2法制备大肠杆菌DH10B感受态及其转化 | 第43-44页 |
| ·碱裂解法制备小量质粒DNA | 第44-45页 |
| ·叶绿体表达载体的改造与构建 | 第45-50页 |
| ·表达载体p322的改造 | 第45页 |
| ·外源基因表达盒的构建 | 第45-46页 |
| ·直接插入外源基因的叶绿体表达载体的构建 | 第46-47页 |
| ·一系列叶绿体表达载体的构建 | 第47-50页 |
| ·PCR及融合PCR | 第50-53页 |
| ·PCR反应设计 | 第50-51页 |
| ·融合PCR介导的连接反应原理 | 第51-52页 |
| ·PCR体系构成及PCR产物的回收 | 第52-53页 |
| ·酶学操作方法 | 第53-55页 |
| ·酶切反应 | 第53-54页 |
| ·酶连反应 | 第54页 |
| ·Klenow酶补平策略 | 第54-55页 |
| ·结果与分析 | 第55-57页 |
| ·PCR及融合PCR的扩增结果 | 第55页 |
| ·阳性质粒的酶切验证 | 第55-56页 |
| ·外源基因插入的方向鉴定 | 第56-57页 |
| ·讨论与小结 | 第57-60页 |
| ·衣藻叶绿体转化的优势 | 第57-58页 |
| ·衣藻叶绿体表达载体的特征 | 第58页 |
| ·衣藻叶绿体转化子的同质化 | 第58-60页 |
| 第三章 衣藻叶绿体的电穿孔转化方法的建立及转基因衣藻的继代培养研究 | 第60-81页 |
| ·实验材料 | 第60-62页 |
| ·主要实验仪器 | 第60页 |
| ·菌株和质粒 | 第60页 |
| ·培养基 | 第60-61页 |
| ·试剂配制 | 第61-62页 |
| ·实验方法 | 第62-66页 |
| ·衣藻培养条件 | 第62页 |
| ·衣藻细胞的形态观察 | 第62页 |
| ·衣藻叶绿体的转化及转化子的筛选 | 第62-64页 |
| ·转化细胞的培养 | 第62-63页 |
| ·衣藻叶绿体的电穿孔转化 | 第63-64页 |
| ·衣藻叶绿体转化子的筛选 | 第64页 |
| ·衣藻总DNA的抽提 | 第64页 |
| ·衣藻转化子的PCR检测 | 第64-65页 |
| ·转化子的继代培养及同质化分析 | 第65-66页 |
| ·结果与分析 | 第66-77页 |
| ·衣藻细胞的生长曲线 | 第66-67页 |
| ·一些转化参数对转化效率的影响 | 第67-71页 |
| ·衣藻细胞生理状况对转化效率的影响 | 第67页 |
| ·电穿孔的电场强度对其转化效率的影响 | 第67-69页 |
| ·抗生素抗性水平对筛选共转化子的影响 | 第69-70页 |
| ·质粒的单独转化与共转化 | 第70页 |
| ·叶绿体转化必须维持叶绿体基因组的正常功能 | 第70-71页 |
| ·衣藻受体细胞的形态观察 | 第71-75页 |
| ·光学显微镜观察 | 第71-72页 |
| ·受体细胞的形态与转化频率密切相关 | 第72-73页 |
| ·细胞壁的电镜观察 | 第73-75页 |
| ·转化子的继代培养与同质化 | 第75-77页 |
| ·转化子的继代培养 | 第75页 |
| ·转基因的丢失 | 第75-76页 |
| ·FdUrd提高转化子的同质化程度 | 第76-77页 |
| ·讨论 | 第77-80页 |
| 小结 | 第80-81页 |
| 第四章 融合抗原基因CTBVP1在大肠杆菌和衣藻叶绿体中的表达 | 第81-104页 |
| ·前言 | 第81-82页 |
| ·材料与方法 | 第82-86页 |
| ·主要实验仪器 | 第82-83页 |
| ·菌株和质粒 | 第83页 |
| ·培养基、试剂和引物 | 第83页 |
| ·蛋白质分析相关试剂 | 第83-85页 |
| ·WESTERN BLOTTING检测相关试剂 | 第85-86页 |
| ·实验方法 | 第86-95页 |
| ·CV1融合抗原基因的原核表达 | 第86-90页 |
| ·CV1重组原核表达载体的构建 | 第86-87页 |
| ·大肠杆菌重组表达菌株的获得 | 第87-88页 |
| ·CV1融合蛋白的表达与纯化 | 第88-90页 |
| ·ANTI-CV1抗体的制备 | 第90-91页 |
| ·CV1抗原蛋白的制备 | 第90-91页 |
| ·试验兔的免疫及Anti-CV1抗体的检测与收获 | 第91页 |
| ·衣藻的培养、转化及总DNA的提取 | 第91-92页 |
| ·衣藻总可溶蛋白的粗提 | 第92页 |
| ·蛋白质电泳分析 | 第92-93页 |
| ·WESTERN BLOTTING分析 | 第93-95页 |
| ·结果与分析 | 第95-99页 |
| ·重组表达质粒PET28A(+)-CV1的酶切验证 | 第95-96页 |
| ·CV1融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达及纯化 | 第96页 |
| ·ANTI-CV1抗体的检测 | 第96页 |
| ·CV1融合蛋白在衣藻叶绿体中的表达与检测 | 第96-99页 |
| ·CV1基因的转化与衣藻转化子的筛选 | 第96-97页 |
| ·转基因衣藻的继代培养 | 第97-98页 |
| ·SDS-PAGE凝胶电泳及Western blotting分析结果 | 第98-99页 |
| ·讨论与展望 | 第99-103页 |
| ·叶绿体表达系统表达疫苗抗原或治疗性蛋白的优势 | 第99页 |
| ·叶绿体可以高水平表达疫苗抗原 | 第99页 |
| ·转基因植物生产口蹄疫疫苗的研究进展 | 第99-100页 |
| ·衣藻叶绿体是生产口服疫苗的潜在平台 | 第100-101页 |
| ·展望 | 第101-103页 |
| 小结 | 第103-104页 |
| 第五章 高活性木聚糖酶毕赤酵母工程菌的初步发酵研究 | 第104-125页 |
| ·前言 | 第104-110页 |
| ·木聚糖的结构及其功能 | 第104-105页 |
| ·木聚糖酶的分类及理化性质 | 第105-107页 |
| ·木聚糖酶在现代工业领域中的应用 | 第107-108页 |
| ·木聚糖酶的研究进展 | 第108-110页 |
| ·本研究的意义 | 第110页 |
| ·材料与方法 | 第110-115页 |
| ·材料 | 第110-111页 |
| ·结构分析及制图软件 | 第110页 |
| ·木聚糖酶基因及重组毕赤酵母工程菌 | 第110-111页 |
| ·主要仪器和试剂 | 第111页 |
| ·培养基和溶液的配制 | 第111页 |
| ·方法 | 第111-115页 |
| ·野生型和突变体木聚糖酶的空间结构分析 | 第111-112页 |
| ·木聚糖酶的活性测定 | 第112-113页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第113页 |
| ·木聚糖酶毕赤酵母工程菌的培养与发酵 | 第113-115页 |
| ·结果与分析 | 第115-120页 |
| ·氨基酸替换改变了木聚糖酶分子的部分功能域 | 第115-117页 |
| ·木聚糖酶活性标准曲线绘制 | 第117页 |
| ·蛋白质浓度测定标准曲线绘制 | 第117-118页 |
| ·重组木聚糖酶的初步发酵生产 | 第118-120页 |
| ·讨论与展望 | 第120-124页 |
| ·讨论 | 第120-123页 |
| ·分子技术改良木聚糖酶的酶学性质 | 第120-122页 |
| ·异源表达增加木聚糖酶的产量 | 第122-123页 |
| ·展望 | 第123-124页 |
| 小结 | 第124-125页 |
| 总结 | 第125-126页 |
| 参考文献 | 第126-139页 |
| 致谢 | 第139-140页 |
| 论文发表 | 第140-141页 |
