重组人胰激肽原酶发酵及复性研究
| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-13页 |
| 第一章 绪论 | 第13-31页 |
| ·胰激肽原酶概述 | 第13-17页 |
| ·化学组成与性质 | 第13-14页 |
| ·激肽原酶的编码表达 | 第14-15页 |
| ·胰激肽原酶的功能 | 第15-16页 |
| ·胰激肽原酶在临床中的应用 | 第16-17页 |
| ·激肽原酶的提取方法 | 第17-20页 |
| ·以猪颌下腺作为原材料 | 第17-18页 |
| ·以猪胰腺作为原材 | 第18-19页 |
| ·其它动物或者组织的来源 | 第19页 |
| ·基因工程手段 | 第19-20页 |
| ·包涵体 | 第20-21页 |
| ·包涵体形成 | 第20-21页 |
| ·减少包涵体形成的策略 | 第21页 |
| ·菌体的裂解以及包涵体的预处理 | 第21页 |
| ·蛋白质复性的方法 | 第21-28页 |
| ·稀释复性法 | 第22页 |
| ·透析复性 | 第22-23页 |
| ·一步透析法 | 第23页 |
| ·多步透析法 | 第23页 |
| ·凝胶过滤复性 | 第23-25页 |
| ·进样方式 | 第24页 |
| ·变性剂浓度 | 第24页 |
| ·蛋白浓度 | 第24-25页 |
| ·进样体积 | 第25页 |
| ·离子交换复性 | 第25-27页 |
| ·复性影响因素 | 第27-28页 |
| ·蛋白质的复性浓度 | 第27页 |
| ·氧化-还原体系 | 第27页 |
| ·离子浓度 | 第27-28页 |
| ·复性体系中变性剂的终浓度 | 第28页 |
| ·复性温度 | 第28页 |
| ·小分子化合物 | 第28页 |
| ·课题研究意义 | 第28-31页 |
| 第二章 KLK 工程菌发酵培养的优化 | 第31-48页 |
| ·引言 | 第31-32页 |
| ·仪器和材料 | 第32-33页 |
| ·试剂和培养基 | 第32页 |
| ·实验菌种 | 第32-33页 |
| ·仪器设备 | 第33页 |
| ·实验方法 | 第33-34页 |
| ·工程菌活化 | 第33-34页 |
| ·工程菌培养 | 第34页 |
| ·种子液培养 | 第34页 |
| ·摇瓶发酵培养 | 第34页 |
| ·菌种保藏 | 第34页 |
| ·发酵中各因素对重组人 KLK 表达影响 | 第34-36页 |
| ·诱导时间 | 第34-35页 |
| ·培养基中 Amp 浓度 | 第35页 |
| ·诱导剂 IPTG 浓度 | 第35页 |
| ·培养基成分 | 第35-36页 |
| ·酵母抽提物 | 第35页 |
| ·胰蛋白胨 | 第35-36页 |
| ·诱导温度 | 第36页 |
| ·分析方法 | 第36-37页 |
| ·SDS-PAGE 分析目的蛋白表达 | 第36-37页 |
| ·菌体浓度测定 | 第37页 |
| ·结果与讨论 | 第37-47页 |
| ·重组人 KLK 工程菌的生长 | 第37-38页 |
| ·诱导时间对于 KLK 表达的影响 | 第38-39页 |
| ·氨苄浓度对 KLK 表达的影响 | 第39-41页 |
| ·IPTG 浓度对于目的蛋白表达影响 | 第41-42页 |
| ·培养基组分对 KLK 表达影响 | 第42-45页 |
| ·酵母抽提物对目的蛋白表达影响 | 第42-44页 |
| ·胰蛋白胨对目的蛋白表达影响 | 第44-45页 |
| ·温度对目的蛋白表达影响 | 第45-47页 |
| ·小结 | 第47-48页 |
| 第三章 重组 KLK 包涵体获得以及传统的复性 | 第48-64页 |
| ·引言 | 第48-49页 |
| ·实验材料和仪器 | 第49-50页 |
| ·实验仪器 | 第49-50页 |
| ·实验材料 | 第50页 |
| ·实验方法 | 第50-53页 |
| ·KLK 发酵与培养 | 第50页 |
| ·KLK 菌体收集与破碎 | 第50-51页 |
| ·KLK 包涵体的洗涤和精致 | 第51页 |
| ·KLK 精制包涵体的变性 | 第51页 |
| ·KLK 的稀释复性 | 第51-52页 |
| ·KLK 的透析复性 | 第52-53页 |
| ·一步透析法 | 第52页 |
| ·多步透析法 | 第52-53页 |
| ·KLK 分析方法 | 第53-56页 |
| ·Brandford 法测定蛋白含量 | 第53-54页 |
| ·人胰激肽原酶活性检测 | 第54-56页 |
| ·配制试剂 | 第55页 |
| ·测定标品的 OD 值酶活关系 | 第55页 |
| ·测定样品的 OD 值变化 | 第55页 |
| ·标准蛋白酶活与 OD 值关系 | 第55-56页 |
| ·SDS-PAGE 电泳 | 第56页 |
| ·结果与讨论 | 第56-62页 |
| ·重组 KLK 工程菌的表达形式 | 第56-58页 |
| ·包涵体洗涤次数的选择 | 第58页 |
| ·包涵体的发酵含量 | 第58页 |
| ·包涵体的变性以后溶液的蛋白浓度 | 第58-59页 |
| ·稀释复性 | 第59-60页 |
| ·透析复性 | 第60-62页 |
| ·一步透析法 | 第60-61页 |
| ·多步透析法 | 第61页 |
| ·一步透析和多步透析的比较 | 第61-62页 |
| ·小结 | 第62-64页 |
| 第四章 人胰激肽原酶的柱复性 | 第64-75页 |
| ·引言 | 第64-65页 |
| ·实验材料和仪器 | 第65页 |
| ·试剂 | 第65页 |
| ·实验仪器 | 第65页 |
| ·实验方法 | 第65-69页 |
| ·发酵，包涵体的制备与变性 | 第65页 |
| ·凝胶过滤复性 | 第65-66页 |
| ·尿素梯度凝胶过滤复性 | 第66-68页 |
| ·离子交换复性 | 第68-69页 |
| ·分析方法 | 第69页 |
| ·KLK 酶活的测定 | 第69页 |
| ·SDS-PAGE 电泳 | 第69页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第69页 |
| ·结果与分析 | 第69-73页 |
| ·KLK 采用凝胶过滤复性结果 | 第69-70页 |
| ·KLK 采用尿素梯度凝胶过滤复性结果 | 第70-72页 |
| ·KLK 不同尿素梯度长度 SEC 复性结果 | 第70-71页 |
| ·KLK 最优尿素梯度长度 SEC 复性结果 | 第71-72页 |
| ·KLK 采用离子交换复性结果 | 第72-73页 |
| ·小结 | 第73-75页 |
| 第五章 结论与建议 | 第75-77页 |
| ·结论 | 第75-76页 |
| ·建议 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-81页 |
| 附录 | 第81-83页 |
| 附录 1：实验仪器 | 第81-82页 |
| 附录 2：实验试剂 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第84-85页 |
| 作者和导师简介 | 第85-86页 |
| 硕士研究生学位论文答辩委员会决议书 | 第86-87页 |
