| 图片目录 | 第1-9页 |
| 表格目录 | 第9-11页 |
| 中文摘要 | 第11-13页 |
| 英文摘要 | 第13-16页 |
| 前言 | 第16-20页 |
| 第一章 类产碱假单胞菌PA7基因启动子的克隆、鉴定与序列分析 | 第20-46页 |
| 摘要 | 第20页 |
| 引言 | 第20-22页 |
| 1．材料和方法 | 第22-32页 |
| 1．1 实验材料 | 第22-24页 |
| 1．1．1 菌株和质粒 | 第22-23页 |
| 1．1．2 试剂及培养基 | 第23-24页 |
| 1．2 实验方法 | 第24-32页 |
| 1．2．1 质粒大批量提取 | 第24-25页 |
| 1．2．2 质粒小批量提取 | 第25页 |
| 1．2．3 类产碱假单胞菌总DNA提取 | 第25页 |
| 1．2．4 总DNA部分酶切 | 第25-26页 |
| 1．2．5 普通琼脂糖凝胶电泳回收法 | 第26页 |
| 1．2．6 酶切、载体去磷酸化、连接 | 第26页 |
| 1．2．7 大肠杆菌高频转化法 | 第26-27页 |
| 1．2．8 大肠杆菌氯化钙转化法 | 第27页 |
| 1．2．9 Southern杂交 | 第27-29页 |
| 1．2．10 DNA测序 | 第29页 |
| 1．2．11 DNA序列分析 | 第29页 |
| 1．2．12 引物设计、合成 | 第29页 |
| 1．2．13 PCR次克隆 | 第29-30页 |
| 1．2．14 类产碱假单胞菌的转化 | 第30-32页 |
| 2．结果 | 第32-39页 |
| 2．1 类产碱假单胞菌基因启动子的重组子的获得 | 第32-33页 |
| 2．2 PA7片段测序及序列分析 | 第33-36页 |
| 2．2．1 启动子序列分析 | 第33页 |
| 2．2．2 启动子序列测序 | 第33-35页 |
| 2．2．3 PA7片段启动子预测分析 | 第35-36页 |
| 2．3 PA7次克隆策略 | 第36-37页 |
| 2．4 PA7次克隆重组子获得及抗性检测 | 第37-38页 |
| 2．5 Southern杂交分析 | 第38页 |
| 2．6 PA7片段的功能鉴定 | 第38-39页 |
| 3．讨论 | 第39-43页 |
| 3．1 启动子探针型质粒的可靠性 | 第39页 |
| 3．2 PA7片段的同源性分析 | 第39-42页 |
| 3．2．1 PA7片段的BLASTn同源性比较 | 第39-40页 |
| 3．2．2 PA7片段的BLASTx同源性比较分析 | 第40-41页 |
| 3．2．3 PA7片段蛋白质保守结构域分析 | 第41-42页 |
| 3．3 PA7片段次克隆及功能鉴定 | 第42-43页 |
| 小结 | 第43-44页 |
| 参考文献 | 第44-46页 |
| 第二章 类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因的克隆及启动子分析 | 第46-68页 |
| 摘要 | 第46页 |
| 引言 | 第46-48页 |
| 1．材料与方法 | 第48-51页 |
| 1．1 实验材料 | 第48页 |
| 1．1．1 菌株和质粒 | 第48页 |
| 1．1．2 试剂及培养基 | 第48页 |
| 1．2 方法 | 第48-51页 |
| 1．2．1 类产碱假单胞菌总DNA的提取 | 第48页 |
| 1．2．2 基因组DNA酶切片段的制备与回收 | 第48-49页 |
| 1．2．3 质粒的提取 | 第49页 |
| 1．2．4 去磷酸化线性质粒的制备 | 第49页 |
| 1．2．5 DNA片段与质粒载体的连接 | 第49页 |
| 1．2．6 大肠杆菌的转化 | 第49页 |
| 1．2．7 探针的放射性标记 | 第49页 |
| 1．2．8 用核酸探针与固定化核酸杂交 | 第49-51页 |
| 2．结果 | 第51-61页 |
| 2．1 类产碱假单胞菌基因组文库的构建 | 第51-52页 |
| 2．2 杀虫蛋白基因阳性克隆的初步筛 | 第52-53页 |
| 2．3 阳性克隆的鉴定 | 第53-56页 |
| 2．3．1 限制酶切分析 | 第53-55页 |
| 2．3．2 杀虫蛋白的基因定位 | 第55页 |
| 2．3．3 pSC1杀虫蛋白基因的次克隆 | 第55页 |
| 2．3．4 Southern杂交 | 第55-56页 |
| 2．4 杀虫蛋白基因的序列测定及分析 | 第56-61页 |
| 2．4．1 杀虫蛋白基因的核苷酸序列 | 第56-58页 |
| 2．4．2 杀虫蛋白的氨基酸序列分析 | 第58-59页 |
| 2．4．3 杀虫蛋白基因序列的同源性比较 | 第59页 |
| 2．4．4 杀虫蛋白基因序列的BLASTx同源性比较 | 第59-60页 |
| 2．4．5 杀虫蛋白基因蛋白质保守结构域分析 | 第60-61页 |
| 2．4．6 与其它细菌毒素蛋白的同源性比较 | 第61页 |
| 3．讨论 | 第61-64页 |
| 3．1 寡聚核苷酸探针杂交 | 第61-62页 |
| 3．2 杀虫蛋白基因启动子 | 第62-64页 |
| 3．3 杀虫蛋白基因信号肽分析 | 第64页 |
| 小结 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-68页 |
| 第三章 基因工程菌构建策略和预测 | 第68-82页 |
| 摘要 | 第68页 |
| 引言 | 第68页 |
| 1．方法 | 第68-69页 |
| 1．1 环菌C-2 Chil 几丁质酶基因超家族预测 | 第68页 |
| 1．2 二级结构预测secondary structure(PHDsec)预测 | 第68-69页 |
| 1．3 信号肽及剪切位点预测 | 第69页 |
| 1．4 DAS跨膜预测 | 第69页 |
| 1．5 Swissmdodel 3D结构预测 | 第69页 |
| 2．结果与讨论 | 第69-80页 |
| 2．1 基因工程菌构建策略及预测 | 第69页 |
| 2．2 环状芽孢杆菌C-2几丁质酶基因Chil分析 | 第69-74页 |
| 2．3 连接1预测 | 第74-76页 |
| 2．4 连接2预测 | 第76-77页 |
| 2．5 蛋白质三级结构预测 | 第77-80页 |
| 2．5．1 几丁质酶裂解区3D结构(CatD)比较 | 第78-79页 |
| 2．5．2 粘连蛋白的Ⅲ型同源单位区3D结构(Fib Ⅲ D)比较 | 第79页 |
| 2．5．3 几丁质绑定区3D结构(ChBD)比较 | 第79-80页 |
| 小结 | 第80页 |
| 参考文献 | 第80-82页 |
| 第四章 几丁质酶基因在类产碱假单胞菌中的表达及鉴定 | 第82-104页 |
| 摘要 | 第82页 |
| 引言 | 第82-84页 |
| 1．材料及方法 | 第84-92页 |
| 1．1 材料 | 第84-86页 |
| 1．1．1 菌株和质粒 | 第84页 |
| 1．1．2 培养基 | 第84-85页 |
| 1．1．3 引物序列 | 第85-86页 |
| 1．1．4 工具酶和生化试剂 | 第86页 |
| 1．2 方法 | 第86-92页 |
| 1．2．1 胶体几丁质的制备 | 第86页 |
| 1．2．2 引物设计 | 第86-87页 |
| 1．2．3 PCR克隆 | 第87-88页 |
| 1．2．4 PCR扩增产物的回收、酶切 | 第88页 |
| 1．2．5 pLAFR3质粒提取 | 第88页 |
| 1．2．6 质粒载体的DNA操作 | 第88-89页 |
| 1．2．7 E.coli 转化子，重组子的筛选 | 第89页 |
| 1．2．8 PCR快速检测阳性克隆 | 第89页 |
| 1．2．9 三亲转化 | 第89-91页 |
| 1．2．10 转化菌的分离筛选 | 第91页 |
| 1．2．11 几丁质酶活性的测定 | 第91-92页 |
| 1．2．12 胞外几丁质酶的浓缩 | 第92页 |
| 1．2．13 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 | 第92页 |
| 1．2．14 室内的蝗虫喂鉰实验 | 第92页 |
| 2．结果 | 第92-97页 |
| 2．1 引物合成及扩增结果 | 第92-93页 |
| 2．2 pLCHI1、pLCHI2质粒的构建 | 第93页 |
| 2．3 三亲转化结果 | 第93-94页 |
| 2．4 几丁质酶基因转化的PCR鉴定 | 第94-95页 |
| 2．5 Southern杂交 | 第95页 |
| 2．6 工程菌几丁质酶活的测定 | 第95页 |
| 2．7 几丁质酶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 | 第95-96页 |
| 2．8 室内的蝗虫喂饲实验 | 第96-97页 |
| 3．讨论 | 第97-100页 |
| 3．1 DMSO对启动子片段LQZ及几丁质酶编码区CSP、CHI扩增的影响 | 第97-98页 |
| 3．2 pLCHI1、pLCHI2质粒的构建 | 第98页 |
| 3．3 三亲转化结果 | 第98-99页 |
| 3．4 几丁质酶活的测定 | 第99-100页 |
| 小结 | 第100页 |
| 参考文献 | 第100-102页 |
| 结论 | 第102-104页 |
| 文献综述 | 第104-136页 |
| 一、几丁质酶在生物防治中的作用 | 第104-122页 |
| 1．几丁质和几丁质酶 | 第104-107页 |
| 2．几丁质酶的生理作用 | 第107-108页 |
| 3．几丁质酶侵蚀无脊椎动物外壳 | 第108页 |
| 4．几丁质酶侵蚀昆虫围食膜 | 第108-109页 |
| 5．几丁质酶对昆虫的防治 | 第109-111页 |
| 6．几丁质酶对植物病原真菌的防治 | 第111-113页 |
| 7．植物几丁质酶以及转几丁质酶基因植物 | 第113-114页 |
| 8．展望 | 第114-115页 |
| 参考文献 | 第115-122页 |
| 二、假单胞菌表达外源基因的研究进展 | 第122-136页 |
| 1．表达载体与表达系统 | 第123-126页 |
| 2．用于运输、整合的载体 | 第126-128页 |
| 3．报告基因与基因表达的检测 | 第128-130页 |
| 4．展望 | 第130-131页 |
| 参考文献 | 第131-136页 |
| 致谢 | 第136-137页 |
| 在校期间发表文章情况 | 第137-138页 |
| 声明 | 第138页 |
