| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-23页 |
| 1 番茄细菌性斑点病研究进展 | 第11-19页 |
| ·番茄细菌性斑点病及其病原菌简介 | 第11-12页 |
| ·植物防御反应机制 | 第12-13页 |
| ·Pto基因家族 | 第13-14页 |
| ·Pto基因 | 第14页 |
| ·Lescpth5基因 | 第14页 |
| ·番茄细菌性斑点病病原菌无毒基因AvrPto/AvrPtoB | 第14-17页 |
| ·无毒基因AvrPto | 第15页 |
| ·无毒基因AvrPtoB | 第15-17页 |
| ·核酮糖1,5-二磷酸小亚基(rbcS)研究进展 | 第17-18页 |
| ·番茄细菌性斑点病原致病分子机制研究进展 | 第18-19页 |
| 2 酵母双杂交系统 | 第19-22页 |
| ·酵母双杂交技术的原理 | 第19-20页 |
| ·酵母双杂交技术的应用 | 第20-21页 |
| ·酵母双杂交系统的优缺点 | 第21-22页 |
| ·酵母双杂交系统相对于其他技术的优点 | 第21页 |
| ·酵母双杂交系统中常见问题 | 第21-22页 |
| 3 本论文研究的目的和意义 | 第22-23页 |
| 第二章 RBCS与AVRPTO/AVRPTOB之间的互作分析 | 第23-48页 |
| 1 实验材料 | 第23-25页 |
| ·供试菌株 | 第23页 |
| ·供试植物 | 第23页 |
| ·培养基 | 第23-24页 |
| ·其他材料 | 第24-25页 |
| 2 实验方法 | 第25-41页 |
| ·pGBKT7质粒载体的制备 | 第25-27页 |
| ·E.coli-pGBKT7质粒的复苏 | 第25页 |
| ·pGBKT7质粒的提取 | 第25-26页 |
| ·pGBKT7载体的酶切 | 第26-27页 |
| ·纯化酶切质粒 | 第27页 |
| ·pGADT7质粒载体的制备 | 第27-29页 |
| ·pGADT7质粒的连接及转化 | 第27-28页 |
| ·pGADT7质粒的提取 | 第28页 |
| ·pGADT7质粒的酶切鉴定 | 第28页 |
| ·pGADT7载体的酶切 | 第28-29页 |
| ·纯化酶切质粒 | 第29页 |
| ·Pst18基因AvrPto/AvrPtoB的克隆 | 第29-32页 |
| ·提取Pst18基因组DNA | 第29-30页 |
| ·引物设计 | 第30页 |
| ·AvrPto/AvrPtoB基因的扩增 | 第30-31页 |
| ·PCR扩增产物回收 | 第31-32页 |
| ·目的片段酶切 | 第32页 |
| ·rbcS基因的克隆 | 第32-35页 |
| ·中蔬四号总RNA的提取 | 第32-33页 |
| ·RNA样品质量检测 | 第33页 |
| ·第一链cDNA的合成 | 第33-34页 |
| ·引物设计 | 第34页 |
| ·PCR反应 | 第34页 |
| ·PCR产物的回收纯化 | 第34-35页 |
| ·目的片段酶切 | 第35页 |
| ·重组质粒的构建 | 第35-36页 |
| ·外源基因和pGBKT7/pGADT7载体的连接 | 第35页 |
| ·连接产物的转化 | 第35页 |
| ·提取阳性克隆的质粒 | 第35页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第35-36页 |
| ·测序鉴定 | 第36页 |
| ·检测融合蛋白的转录激活特性 | 第36-39页 |
| ·LiAc方法制备酵母感受态细胞 | 第36-37页 |
| ·纯化的质粒分别转化酵母菌株AH109 | 第37-39页 |
| ·DNA-BD融合蛋白对酵母细胞的毒性 | 第39页 |
| ·共转化验证rbcS与AvrPto/AvrPtoB之间的互作 | 第39-41页 |
| ·共转化rbcS与AvrPto/AvrPtoB | 第39-40页 |
| ·对照 | 第40-41页 |
| ·再次共转化验证rbcS与AvrPto/AvrPtoB之间的互作 | 第41页 |
| 3 结果与分析 | 第41-46页 |
| ·蛋白互作分析流程图 | 第41页 |
| ·AvrPto、AvrPtoB及rbcS基因的克隆 | 第41-43页 |
| ·基因组DNA提取结果 | 第41-42页 |
| ·中蔬四号总RNA的提取 | 第42页 |
| ·PCR扩增 | 第42-43页 |
| ·构建成功的诱饵载体酶切鉴定 | 第43-44页 |
| ·自激活和毒性检测结果 | 第44页 |
| ·载体插入片段的读码框验证 | 第44-45页 |
| ·共转化验证rbcS与AvrPto/AvrPtoB的互作 | 第45-46页 |
| 4 小结和讨论 | 第46-48页 |
| 第三章 共转化筛选PST18DSCDNA与LESCPTH5互作的基因 | 第48-68页 |
| 1 实验材料 | 第48-51页 |
| 2 实验方法 | 第51-61页 |
| ·诱饵载体pGBKT7-Lescpth5的构建 | 第51-52页 |
| ·中蔬四号总RNA提取 | 第51页 |
| ·第一链cDNA合成 | 第51页 |
| ·引物设计 | 第51页 |
| ·PCR扩增 | 第51-52页 |
| ·PCR扩增产物回收 | 第52页 |
| ·目的片段Lescpth5酶切 | 第52页 |
| ·pGBKT7载体制备 | 第52页 |
| ·重组质粒的构建 | 第52页 |
| ·检测融合蛋白的转录激活特性 | 第52页 |
| ·构建Pst18的cDNA文库 | 第52-55页 |
| ·Trizol法提取Pst18总RNA | 第52-53页 |
| ·RNA样品纯化 | 第53页 |
| ·RNA样品质量检测 | 第53页 |
| ·第一链cDNA的合成 | 第53-54页 |
| ·LD-PCR扩增双链cDNA | 第54-55页 |
| ·dscDNA的浓缩 | 第55页 |
| ·共转化筛选和Lescpth5互作的基因 | 第55-57页 |
| ·LiAc方法制备酵母感受态细胞 | 第55-56页 |
| ·共转化方法筛选dscDNA中与Lescpth5互作的基因 | 第56页 |
| ·对照 | 第56-57页 |
| ·二次转化 | 第57页 |
| ·阳性克隆分析与鉴定 | 第57-61页 |
| ·阳性克隆β-半乳糖苷酶分析 | 第57-58页 |
| ·菌落PCR筛选阳性克隆 | 第58页 |
| ·酵母质粒的提取(液氮冻融法) | 第58-59页 |
| ·电激感受态的制作 | 第59页 |
| ·电激转化 | 第59页 |
| ·质粒提取以及双酶切鉴定 | 第59-60页 |
| ·再次共转化验证 | 第60页 |
| ·β-半乳糖苷酶再次验证 | 第60页 |
| ·阳性克隆测序 | 第60-61页 |
| 3 结果与分析 | 第61-65页 |
| ·诱饵载体pGBKT7--Lescpth5酶切鉴定 | 第61页 |
| ·自激活和毒性检测结果 | 第61页 |
| ·LD-PCR扩增dscDNA结果 | 第61-62页 |
| ·Pst18总RNA的提取 | 第61-62页 |
| ·LD-PCR扩增dscDNA | 第62页 |
| ·共转化结果 | 第62-63页 |
| ·互作的阳性克隆分析 | 第63页 |
| ·菌落PCR的验证 | 第63-64页 |
| ·AD质粒酶切鉴定结果 | 第64页 |
| ·再次共转化验证 | 第64-65页 |
| ·测序结果与分析 | 第65页 |
| 4 小结与讨论 | 第65-68页 |
| 第四章 结论与讨论 | 第68-71页 |
| 1 结论 | 第68页 |
| ·利用酵母双杂交技术验证了rbcS与AvrPto/AvrPtoB之间互作可能是假阳性 | 第68页 |
| ·利用酵母双杂交技术筛选到与Lescpth5有微弱互作的蛋白 | 第68页 |
| 2 讨论 | 第68-69页 |
| 3 下一步研究设想 | 第69-71页 |
| 参考文献 | 第71-76页 |
| 英文缩略表 | 第76-77页 |
| 致谢 | 第77页 |
