| 中文摘要 | 第1-13页 |
| Abstract | 第13-17页 |
| 前言 | 第17-22页 |
| 选题背景 | 第17-20页 |
| 本研究前期工作基础 | 第20页 |
| 本研究目的及意义 | 第20-22页 |
| 第一章 四川山地乌骨鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的克隆与序列分析 | 第22-41页 |
| 1. 引言 | 第22-23页 |
| 2. 材料 | 第23-24页 |
| ·实验动物 | 第23页 |
| ·质粒和宿主菌 | 第23页 |
| ·工具酶与主要试剂 | 第23-24页 |
| ·主要培养基及溶液的配制 | 第24页 |
| 3. 方法 | 第24-29页 |
| ·引物设计与合成 | 第24页 |
| ·四川山地乌骨鸡外周血淋巴细胞的分离与诱导培养 | 第24-25页 |
| ·细胞总RNA的提取 | 第25页 |
| ·四川山地乌骨鸡GM-CSF基因的RT-PCR扩增 | 第25-26页 |
| ·四川山地乌骨鸡GM-CSF基因的克隆与鉴定 | 第26-29页 |
| ·四川山地乌骨鸡GM-CSF序列测定 | 第29页 |
| ·四川山地乌骨鸡GM-CSF基因的生物信息学分析 | 第29页 |
| 4. 结果 | 第29-39页 |
| ·总RNA的检测 | 第29页 |
| ·四川山地乌骨鸡GM-CSF基因的RT-PCR扩增结果 | 第29-30页 |
| ·四川山地乌骨鸡GM-CSF基因的克隆与鉴定 | 第30-31页 |
| ·四川山地乌骨鸡GM-CSF序列测定 | 第31页 |
| ·四川山地乌骨鸡GM-CSF序列分析 | 第31-39页 |
| ·不同物种GM-CSF序列比较及进化树分析 | 第31-35页 |
| ·GM-CSF蛋白糖基化位点的预测 | 第35-36页 |
| ·GM-CSF蛋白信号肽预测 | 第36-37页 |
| ·GM-CSF成熟蛋白疏水性预测 | 第37-38页 |
| ·GM-CSF成熟蛋白的二级结构预测分析 | 第38页 |
| ·GM-CSF成熟蛋白的三维结构预测分析 | 第38-39页 |
| 5. 讨论 | 第39-40页 |
| ·淋巴细胞的分离 | 第39页 |
| ·淋巴细胞的刺激方法 | 第39页 |
| ·总RNA的提取 | 第39-40页 |
| ·鸡GM-CSF基因序列分析 | 第40页 |
| 6. 小结 | 第40-41页 |
| 第二章 四川山地乌骨鸡GM-CSF原核表达、纯化及其抗体的制备 | 第41-60页 |
| 1. 引言 | 第41-42页 |
| 2. 材料 | 第42-44页 |
| ·宿主菌、质粒、试验动物 | 第42页 |
| ·工具酶与主要试剂 | 第42页 |
| ·主要溶液的配制 | 第42-43页 |
| ·主要仪器设备 | 第43-44页 |
| 3. 方法 | 第44-51页 |
| ·四川山地乌骨鸡GM-CSF基因表达片断的克隆 | 第44-45页 |
| ·四川山地乌骨鸡GM-CSF基因原核表达载体p32GM-CSF的构建 | 第45-47页 |
| ·重组表达质粒p32GM-CSF的小量诱导表达 | 第47-49页 |
| ·重组表达蛋白的纯化与复性 | 第49-50页 |
| ·兔抗鸡GM-CSF蛋白多克隆抗体的制备与Western blot分析 | 第50-51页 |
| 4. 结果 | 第51-57页 |
| ·四川山地乌骨鸡GM-CSF基因的表达片断的扩增结果 | 第51-52页 |
| ·四川山地乌骨鸡GM-CSF基因表达片断的克隆 | 第52页 |
| ·四川山地乌骨鸡GM-CSF基因原核表达载体p32GM-CSF的构建 | 第52-53页 |
| ·重组表达质粒的小量诱导表达 | 第53页 |
| ·重组蛋白表达特性的分析 | 第53-55页 |
| ·重组表达蛋白的纯化 | 第55页 |
| ·兔抗鸡GM-CSF蛋白高免血清的效价的测定 | 第55页 |
| ·GM-CSF蛋白的Wstem blot分析 | 第55-57页 |
| 5. 讨论 | 第57-58页 |
| ·表达载体的选择 | 第57页 |
| ·重组蛋白表达条件的优化 | 第57页 |
| ·包涵体的洗涤与溶解 | 第57-58页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第58页 |
| 6. 小结 | 第58-60页 |
| 第三章 四川山地乌骨鸡GM-CSF真核表达载体的构建及在COS-7细胞表达与活性分析 | 第60-75页 |
| 1. 引言 | 第60-61页 |
| 2. 材料 | 第61-63页 |
| ·质粒、宿主菌和细胞株 | 第61页 |
| ·工具酶及主要试剂 | 第61-62页 |
| ·主要溶液的配制 | 第62页 |
| ·主要仪器设备 | 第62-63页 |
| 3. 方法 | 第63-69页 |
| ·真核表达质粒pVAX-chGM-CSF的构建 | 第63-65页 |
| ·重组真核表达质粒pVAX-chGM-CSF的体外表达 | 第65-68页 |
| ·四川山地乌骨鸡GM-CSF蛋白活性检测 | 第68-69页 |
| ·骨髓细胞的制备 | 第68页 |
| ·骨髓细胞增殖实验 | 第68-69页 |
| 4. 结果 | 第69-72页 |
| ·真核表达质粒pVAX-chGM-CSF的鉴定 | 第69-70页 |
| ·重组质粒转染细胞后转录产物的RT-PCR检测 | 第70页 |
| ·重组质粒转染细胞后表达产物的间接免疫荧光检测 | 第70-71页 |
| ·四川山地乌骨鸡GM-CSF重组蛋白活性检测 | 第71-72页 |
| 5. 讨论 | 第72-74页 |
| ·真核表达系统的选择 | 第72页 |
| ·细胞转染方法的选择 | 第72-73页 |
| ·鸡GM-CSF蛋白活性的研究 | 第73-74页 |
| 6. 小结 | 第74-75页 |
| 第四章 马立克病毒(MDV)VP22的克隆以及与IBV S1、M、N融合表达载体的构建 | 第75-94页 |
| 1. 引言 | 第75-76页 |
| 2. 材料 | 第76-77页 |
| ·毒株与菌株 | 第76页 |
| ·工具酶与主要试剂 | 第76-77页 |
| ·主要仪器设备 | 第77页 |
| 3. 方法 | 第77-86页 |
| ·MDV弱毒株VP22的克隆与鉴定 | 第77-79页 |
| ·IBV的S1、M、N基因及VP22基因的克隆及鉴定 | 第79-82页 |
| ·引物的设计 | 第79-80页 |
| ·PCR扩增 | 第80-81页 |
| ·PCR产物的胶回收纯化 | 第81页 |
| ·IBV的S1、M、N、VP22基因与T载体的连接 | 第81页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第81-82页 |
| ·IBV S1、M、N基因与VP22融合表达载体的构建与体外表达 | 第82-86页 |
| ·真核表达质粒pVAX-VP22的构建与鉴定 | 第82-84页 |
| ·pVAX-VP22/S1、pVAX-VP22/M、pVAX-VP22/N的构建 | 第84-85页 |
| ·pVAX-VP22/S1、pVAX-VP22/M、pVAX-VP22/N的体外表达 | 第85-86页 |
| 4. 结果 | 第86-92页 |
| ·VP22基因的PCR扩增结果 | 第86页 |
| ·重组质粒pMD18-VP22的酶切鉴定 | 第86-87页 |
| ·VP22序列 | 第87-88页 |
| ·IBV的S1、M、N及MDV VP22基因的克隆 | 第88页 |
| ·真核表达质粒pVAX-VP22的构建 | 第88页 |
| ·pVAX-VP22/S1、pVAX-VP22/M、pVAX-VP22/N的构建 | 第88-89页 |
| ·重组质粒转染细胞后转录产物的RT-PCR检测 | 第89-90页 |
| ·重组质粒转染细胞后表达产物的间接免疫荧光检测 | 第90-92页 |
| 5. 讨论 | 第92-93页 |
| ·采用VP22基因增强DNA疫苗免疫效果的策略 | 第92-93页 |
| ·VP22的N端连接和C端连接的选择 | 第93页 |
| 6. 小结 | 第93-94页 |
| 第五章 四川山地乌骨鸡GM-CSF、MDV的VP22对IBV DNA疫苗免疫佐剂效应的研究 | 第94-123页 |
| 1. 引言 | 第95-96页 |
| 2. 材料 | 第96-97页 |
| ·质粒、实验动物和攻毒用毒株 | 第96页 |
| ·主要试剂 | 第96-97页 |
| ·主要仪器设备 | 第97页 |
| 3. 方法 | 第97-102页 |
| ·质粒的大量提取和纯化 | 第97-98页 |
| ·脂质体的制备 | 第98页 |
| ·DNA疫苗的配制 | 第98-99页 |
| ·试验鸡分组及免疫 | 第99页 |
| ·特异性IBV血清抗体的ELISA检测 | 第99-100页 |
| ·外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞百分比含量的检测 | 第100页 |
| ·外周血淋巴细胞的制备 | 第100页 |
| ·T淋巴细胞亚类的测定 | 第100页 |
| ·淋巴细胞增殖试验 | 第100-101页 |
| ·鸡脾淋巴细胞的分离 | 第100-101页 |
| ·鸡脾淋巴细胞增殖试验 | 第101页 |
| ·攻毒保护实验 | 第101-102页 |
| ·攻毒后发病情况 | 第101页 |
| ·攻毒后肾脏IBV病毒的检测 | 第101-102页 |
| 4. 结果 | 第102-117页 |
| ·质粒的鉴定 | 第102-103页 |
| ·脂质体的电镜观察 | 第103页 |
| ·DNA疫苗免疫后ELISA抗体的检测结果 | 第103-106页 |
| ·DNA疫苗免疫后外周血淋巴细胞亚类的检测结果 | 第106-113页 |
| ·免疫后外周血CD3+T淋巴细胞亚群数量的变化 | 第106-107页 |
| ·免疫后外周血CD3+CD4+T淋巴细胞亚群数量的变化 | 第107-110页 |
| ·免疫后外周血CD3+CD8+T淋巴细胞亚群数量的变化 | 第110-113页 |
| ·DNA疫苗免疫后脾淋巴细胞增殖结果 | 第113-115页 |
| ·攻毒实验结果 | 第115-117页 |
| ·攻毒后发病及死亡情况 | 第115页 |
| ·攻毒后病毒RT-PCR检测 | 第115-117页 |
| 5. 讨论 | 第117-121页 |
| ·DNA疫苗的制备 | 第117-118页 |
| ·淋巴细胞的制备 | 第118页 |
| ·免疫保护力的评价 | 第118页 |
| ·细胞因子GM-CSF对IBV核酸疫苗佐剂效应分析 | 第118-120页 |
| ·VP22对IBV DNA疫苗免疫原性的增强作用 | 第120-121页 |
| 6. 小结 | 第121-123页 |
| 结论 | 第123-125页 |
| 文献综述 | 第125-143页 |
| 1. 细胞因子作为基因佐剂研究进展 | 第125-132页 |
| 2. VP22蛋白转导功能及作为基因工程疫苗佐剂的研究进展 | 第132-138页 |
| 3. 鸡传染性支气管炎病毒基因工程疫苗研究进展 | 第138-143页 |
| 参考文献 | 第143-153页 |
| 致谢 | 第153-155页 |
| 在读博士期间发表的论文情况 | 第155页 |
