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表达蛋白酶的米曲霉工程菌构建及发酵特性研究

摘要第14-16页
Abstract第16-18页
第一章 文献综述第19-35页
    1.1 米曲霉作为外源表达宿主研究进展第19-26页
        1.1.1 米曲霉的基本特性第19页
        1.1.2 米曲霉在食品工业中的应用第19-20页
        1.1.3 米曲霉表达系统研究进展第20-24页
        1.1.4 自剪切肽在多顺反子载体构建中的应用第24-26页
    1.2 微生物蛋白酶第26-30页
        1.2.1 微生物蛋白酶的分类第26页
        1.2.2 碱性蛋白酶第26-27页
        1.2.3 中性蛋白酶第27-28页
        1.2.4 酸性蛋白酶第28页
        1.2.5 微生物蛋白酶在食品工业的应用第28-29页
        1.2.6 微生物蛋白酶的外源表达第29-30页
    1.3 微生物发酵豆粕生产大豆多肽研究进展第30-33页
        1.3.1 豆粕蛋白资源利用现状第30页
        1.3.2 微生物发酵法生产大豆多肽第30-32页
        1.3.3 大豆多肽生物活性研究第32-33页
    1.4 本研究的目的意义及主要研究内容第33-35页
        1.4.1 目的意义第33页
        1.4.2 主要研究内容第33-35页
第二章 不同蛋白酶基因的扩增及序列分析第35-57页
    2.1 材料与方法第35-44页
        2.1.1 试验材料第35-37页
        2.1.2 地衣芽胞杆菌碱性蛋白基因subC、aprB的扩增第37-38页
        2.1.3 短小芽胞杆菌碱性蛋白基因asp的扩增第38-39页
        2.1.4 黑曲霉总RNA的提取第39-40页
        2.1.5 黑曲霉RNA反转录合成cDNA第40页
        2.1.6 黑曲霉酸性蛋白酶基因的扩增第40-41页
        2.1.7 PCR产物的回收纯化第41-42页
        2.1.8 目的基因与pMD?19(Simple)载体的连接、转化及阳性克隆的筛选第42-43页
        2.1.9 阳性克隆菌株中质粒的提取第43-44页
        2.1.10 目的基因的测序和序列分析第44页
    2.2 结果与分析第44-54页
        2.2.1 碱性蛋白酶基因扩增的结果第44-45页
        2.2.2 碱性蛋白酶基因序列比对及分析第45-49页
        2.2.3 黑曲霉总RNA提取的结果第49页
        2.2.4 酸性蛋白酶基因扩增的结果第49-50页
        2.2.5 酸性蛋白酶基因序列比对及分析第50-53页
        2.2.6 不同基因编码蛋白酶的信号肽序列分析结果第53-54页
    2.3 讨论与小结第54-57页
        2.3.1 讨论第54-55页
        2.3.2 本章小结第55-57页
第三章 不同蛋白酶基因表达载体的构建第57-75页
    3.1 材料与方法第57-67页
        3.1.1 试验材料第57-59页
        3.1.2 米曲霉表达载体阅读框的构建第59-63页
        3.1.3 碱性蛋白酶基因表达载体的构建第63-64页
        3.1.4 酸性蛋白酶基因表达载体的构建第64-65页
        3.1.5 碱性蛋白酶基因串联表达载体的构建第65-67页
    3.2 结果与分析第67-73页
        3.2.1 米曲霉表达载体阅读框构建的结果第67-68页
        3.2.2 碱性蛋白酶基因subC表达载体构建的结果第68-70页
        3.2.3 酸性蛋白酶基因表达载体构建的结果第70-71页
        3.2.4 碱性蛋白酶基因串联表达载体的构建第71-73页
    3.3 讨论与小结第73-75页
        3.3.1 讨论第73-74页
        3.3.2 本章小结第74-75页
第四章 根瘤农杆菌介导表达载体转化米曲霉第75-87页
    4.1 材料与方法第75-81页
        4.1.1 试验材料第75-77页
        4.1.2 不同表达载体转化根瘤农杆菌试验第77-78页
        4.1.3 潮霉素对米曲霉最小抑菌浓度的确定第78页
        4.1.4 根瘤农杆菌介导表达载体转化米曲霉第78-79页
        4.1.5 根瘤农杆菌介导转化体系的优化第79页
        4.1.6 米曲霉转化子基因组PCR检测第79-80页
        4.1.7 米曲霉转化子RT-PCR检测第80-81页
    4.2 结果与分析第81-85页
        4.2.1 表达载体转化根瘤农杆菌试验结果第81页
        4.2.2 潮霉素B对米曲霉最小抑菌浓度试验结果第81-82页
        4.2.3 根瘤农杆菌介导转化体系优化结果第82-84页
        4.2.4 米曲霉转化子基因组PCR检测结果第84-85页
        4.2.5 米曲霉转化子RT-PCR检测结果第85页
    4.3 讨论与小节第85-87页
        4.3.1 讨论第85-86页
        4.3.2 本章小结第86-87页
第五章 不同米曲霉工程菌发酵作用研究第87-105页
    5.1 材料与方法第87-92页
        5.1.1 试验材料第87-88页
        5.1.2 不同菌株蛋白酶活力测定第88-89页
        5.1.3 不同菌株发酵产物多肽含量测定第89页
        5.1.4 不同菌株发酵产物中氨基酸含量分析第89-90页
        5.1.5 不同菌株发酵产物SDS-PAGE分析第90页
        5.1.6 扫描电镜观察不同菌株发酵产物结构第90页
        5.1.7 不同米曲霉工程菌发酵产物的超滤分离第90页
        5.1.8 凝胶过滤法测定不同菌株发酵产物多肽分子量分布第90页
        5.1.9 不同菌株发酵产物中各组分抗氧化活性的测定第90-91页
        5.1.10 数据统计分析第91-92页
    5.2 结果与分析第92-102页
        5.2.1 不同米曲霉工程菌蛋白酶活力比较第92-93页
        5.2.2 不同米曲霉工程菌发酵对多肽转化率的影响第93页
        5.2.3 不同米曲霉发酵对产物中氨基酸含量的影响第93-95页
        5.2.4 不同米曲霉工程菌发酵豆粕SDS-PAGE电泳结果第95-96页
        5.2.5 不同米曲霉发酵对豆粕超微结构的影响第96-98页
        5.2.6 不同菌株发酵产物多肽分子量分布测定结果第98-100页
        5.2.7 不同样品总还原能力测定结果第100页
        5.2.8 不同样品DPPH自由基清除作用结果第100-101页
        5.2.9 不同样品对羟基自由基清除作用结果第101-102页
    5.3 讨论与小结第102-105页
        5.3.1 讨论第102-104页
        5.3.2 本章小结第104-105页
第六章 米曲霉工程菌发酵条件优化及酶的分离纯化与性质研究第105-123页
    6.1 材料与方法第105-108页
        6.1.1 试验材料第105-106页
        6.1.2 米曲霉工程菌pep发酵条件单因素试验第106页
        6.1.3 响应面法对发酵条件的优化第106页
        6.1.4 米曲霉工程菌asp、pep发酵粗酶液的提取第106-107页
        6.1.5 硫酸铵初步分离第107页
        6.1.6 蛋白酶DEAE-SepharoseF.F.阴离子交换层析第107页
        6.1.7 蛋白酶SephadexG-150凝胶过滤层析第107页
        6.1.8 酶分子量及含量分析第107页
        6.1.9 蛋白酶酶学性质研究第107-108页
    6.2 结果与分析第108-120页
        6.2.1 米曲霉pep发酵条件单因素试验结果第108-110页
        6.2.2 响应面分析结果第110-113页
        6.2.3 硫酸铵盐析结果第113页
        6.2.4 碱性蛋白酶ASP的纯化结果及分子量测定第113-115页
        6.2.5 酸性蛋白酶PEP纯化结果及分子量测定第115-116页
        6.2.6 蛋白酶酶学特性研究结果第116-120页
    6.3 讨论与小结第120-123页
        6.3.1 讨论第120-122页
        6.3.2 本章小结第122-123页
第七章 结论、创新点与展望第123-127页
    7.1 全文结论第123-125页
    7.2 创新点第125页
    7.3 展望第125-127页
参考文献第127-139页
附录第139-140页
致谢第140-141页
攻读博士学位期间发表文章第141-142页

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