| 致谢 | 第4-9页 |
| 摘要 | 第9-11页 |
| 1 文献综述 | 第11-20页 |
| 1.1 麦根腐平脐蠕孢研究概述 | 第11-17页 |
| 1.1.1 小麦根腐病的发生 | 第11页 |
| 1.1.2 麦根腐平脐蠕孢的形态特征 | 第11页 |
| 1.1.3 麦根腐平脐蠕孢的生活史 | 第11-12页 |
| 1.1.4 麦根腐平脐蠕孢造成的为害 | 第12-13页 |
| 1.1.5 麦根腐平脐蠕孢致病的分子机制研究 | 第13-15页 |
| 1.1.6 防治方法 | 第15-17页 |
| 1.1.6.1 农业防治 | 第15页 |
| 1.1.6.2 生物防治 | 第15-16页 |
| 1.1.6.3 化学防治 | 第16页 |
| 1.1.6.4 抗病品种 | 第16-17页 |
| 1.2 分泌蛋白的研究概述 | 第17-19页 |
| 1.2.1 分泌蛋白 | 第17-18页 |
| 1.2.2 病原菌中分泌蛋白的研究进展 | 第18-19页 |
| 1.3 本研究的目的和意义 | 第19-20页 |
| 2 引言 | 第20-21页 |
| 3 材料与方法 | 第21-40页 |
| 3.1 CsSP3/CsSP4基因敲除盒构建的材料与方法 | 第21-26页 |
| 3.1.1 材料、试剂和仪器 | 第21-22页 |
| 3.1.1.1 试验菌株及质粒 | 第21页 |
| 3.1.1.2 试验相关试剂及配制 | 第21-22页 |
| 3.1.1.3 试验所用的仪器 | 第22页 |
| 3.1.2 试验方法 | 第22-26页 |
| 3.1.2.1 基因组DNA的提取——CTAB法 | 第22页 |
| 3.1.2.2 质粒pKOV21的制备 | 第22-23页 |
| 3.1.2.3 基因序列的获取与敲除引物设计 | 第23-25页 |
| 3.1.2.4 Split-PCR方法构建基因敲除盒 | 第25-26页 |
| 3.2 CsSP3/CsSP4基因敲除原生质体转化的材料与方法 | 第26-27页 |
| 3.2.1 材料、试剂和仪器 | 第26页 |
| 3.2.1.1 试验菌株 | 第26页 |
| 3.2.1.2 试验相关试剂及配制 | 第26页 |
| 3.2.1.3 试验所用的仪器 | 第26页 |
| 3.2.2 试验方法 | 第26-27页 |
| 3.2.2.1 野生型麦根腐平脐蠕孢原生质体的制备 | 第26-27页 |
| 3.2.2.2 PEG介导的原生质体转化 | 第27页 |
| 3.2.2.3 敲除突变体的初步筛选 | 第27页 |
| 3.3 CsSP3/CsSP4转化子验证的材料与方法 | 第27-30页 |
| 3.3.1 材料、试剂和仪器 | 第27-28页 |
| 3.3.1.1 试验相关试剂及配制 | 第27-28页 |
| 3.3.1.2 试验所用的仪器 | 第28页 |
| 3.3.2 试验方法 | 第28-30页 |
| 3.3.2.1 四对引物的PCR检测 | 第28页 |
| 3.3.2.2 Southern杂交验证 | 第28-30页 |
| 3.4 CsSP3/CsSP4突变体生长性状和致病性检测 | 第30-32页 |
| 3.4.1 材料、试剂和仪器 | 第30页 |
| 3.4.1.1 材料 | 第30页 |
| 3.4.1.2 试验相关试剂及配制 | 第30页 |
| 3.4.1.3 试验所用的仪器 | 第30页 |
| 3.4.2 试验方法 | 第30-32页 |
| 3.4.2.1 菌落形态观察及生长速度测定 | 第30-31页 |
| 3.4.2.2 产孢量测定 | 第31页 |
| 3.4.2.3 H_2O_2压力筛选试验 | 第31页 |
| 3.4.2.4 洋葱内表皮侵染试验 | 第31页 |
| 3.4.2.5 小麦叶片孢子悬浮液接种 | 第31页 |
| 3.4.2.6 小麦茎基部接种试验 | 第31-32页 |
| 3.4.2.7 盆栽接种试验 | 第32页 |
| 3.5 CsSP3基因敲除转化子功能回复验证 | 第32-35页 |
| 3.5.1 材料、试剂和仪器 | 第32页 |
| 3.5.1.1 试验材料 | 第32页 |
| 3.5.1.2 试验相关试剂及配制 | 第32页 |
| 3.5.1.3 试验所用的仪器 | 第32页 |
| 3.5.2 试验方法 | 第32-35页 |
| 3.5.2.1 CsSP3基因互补引物的设计 | 第32-34页 |
| 3.5.2.2 CsSP3基因互补载体的构建 | 第34页 |
| 3.5.2.3 互补载体转化?cssp3及互补转化子的筛选 | 第34页 |
| 3.5.2.4 互补转化子功能回复鉴定 | 第34-35页 |
| 3.6 CsSP3基因编码蛋白的表达和亚细胞定位 | 第35-40页 |
| 3.6.1 材料、试剂和仪器 | 第35页 |
| 3.6.1.1 试验材料 | 第35页 |
| 3.6.1.2 试验相关试剂及配制 | 第35页 |
| 3.6.1.3 试验所用的仪器 | 第35页 |
| 3.6.2 试验方法 | 第35-40页 |
| 3.6.2.1 CsSP3基因亚细胞定位引物的设计 | 第35-36页 |
| 3.6.2.2 CsSP3基因定位载体的构建 | 第36页 |
| 3.6.2.3 CsSP3基因定位载体原生质体转化及筛选 | 第36页 |
| 3.6.2.4 荧光显微镜观察CsSp3-GFP融合蛋白表达 | 第36-37页 |
| 3.6.2.5 CsSP3基因亚细胞定位转化子RNA验证 | 第37页 |
| 3.6.2.6 CsSP3基因亚细胞定位pKNTG载体引物的设计 | 第37-39页 |
| 3.6.2.7 CsSP3基因亚细胞定位pKNTG载体构建 | 第39页 |
| 3.6.2.8 CsSP3基因定位pKNTG载体原生质体转化及筛选 | 第39页 |
| 3.6.2.9 荧光显微镜观察pKNTG-CsSp3-GFP融合蛋白表达和亚细胞定位 | 第39-40页 |
| 4 结果与分析 | 第40-55页 |
| 4.1 CsSP3/CsSP4基因敲除盒构建 | 第40-43页 |
| 4.1.1 CsSP3/CsSP4基因及蛋白序列分析 | 第40-42页 |
| 4.1.1.1 CsSP3/CsSP4基因转录组数据分析 | 第40页 |
| 4.1.1.2 CsSP3/CsSP4基因及蛋白序列分析 | 第40-42页 |
| 4.1.2 CsSP3/CsSP4基因敲除盒的构建 | 第42-43页 |
| 4.1.2.1PCR扩增侧翼同源片断K1、K2、L1、L2、H1、H2 | 第42-43页 |
| 4.1.2.2 重叠PCR获得K1H1、K2H2、L1H1、L2H2融合片段 | 第43页 |
| 4.2 ?cssp3/?cssp4转化子验证 | 第43-44页 |
| 4.2.1 四对引物的PCR检测 | 第43-44页 |
| 4.2.2 Southernblot验证 | 第44页 |
| 4.3 ?cssp3/?cssp4突变体生长性状和致病性检测 | 第44-49页 |
| 4.3.1 ?cssp3/?cssp4缺失突变体表型变化 | 第44-46页 |
| 4.3.2 ?cssp3缺失突变体对H2O2耐受性无变化 | 第46页 |
| 4.3.3 ?cssp3缺失突变体在洋葱内表皮中侵染菌丝减少 | 第46-47页 |
| 4.3.4 ?cssp3缺失突变体对小麦的致病力减弱/?cssp4转化子对小麦致病力无影响 | 第47-49页 |
| 4.3.4.1 小麦叶片孢子侵染实验表明?cssp3致病性减弱而?cssp4致病性无影响 | 第47-48页 |
| 4.3.4.2 小麦茎基部侵染表明?cssp3致病性减弱/?cssp4致病性无影响 | 第48页 |
| 4.3.4.3 室内盆栽实验显示?cssp3突变体致病性减弱 | 第48-49页 |
| 4.4 CsSP3基因功能回复验证 | 第49-50页 |
| 4.4.1 ?cssp3互补载体的构建 | 第49-50页 |
| 4.4.2 ?cssp3互补转化子的获得 | 第50页 |
| 4.4.3 CsSP3基因使?cssp3缺失突变体表型和致病力恢复 | 第50页 |
| 4.5 CsSP3基因编码蛋白的过量表达和亚细胞定位 | 第50-55页 |
| 4.5.1 CsSP3基因亚细胞定位载体的构建 | 第50-51页 |
| 4.5.2 ?cssp3定位转化子的获得以及CsSp3-GFP融合蛋白表达 | 第51页 |
| 4.5.3 ?cssp3定位转化子的RNA检测 | 第51-52页 |
| 4.5.4 CsSP3基因亚细胞pKNTG-定位载体的构建 | 第52页 |
| 4.5.5 CsSP3基因pKNTG-定位转化子的获得 | 第52页 |
| 4.5.6 pKNTG-CsSp3-GFP融合蛋白表达及亚细胞定位 | 第52-55页 |
| 5 结论与讨论 | 第55-57页 |
| 5.1 结论 | 第55页 |
| 5.2 讨论 | 第55-57页 |
| 参考文献 | 第57-64页 |
| ABSTRACT | 第64-65页 |
