| 摘要 | 第6-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 英文缩略表 | 第14-15页 |
| 第一章 引言 | 第15-34页 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎的概述 | 第15页 |
| 1.2 传染性支气管炎病毒的病原学 | 第15-20页 |
| 1.2.1 冠状病毒的分类和IBV地位 | 第15-16页 |
| 1.2.2 IBV的基因组结构 | 第16-17页 |
| 1.2.3 纤突(S)蛋白 | 第17-18页 |
| 1.2.4 核衣壳(N)蛋白 | 第18页 |
| 1.2.5 膜(M)蛋白 | 第18-19页 |
| 1.2.6 小囊膜(E)蛋白 | 第19页 |
| 1.2.7 非结构蛋白和辅助蛋白 | 第19-20页 |
| 1.3 病毒复制转录机制 | 第20页 |
| 1.4 血清型和毒株的变异 | 第20-21页 |
| 1.5 IBVRNA突变和重组 | 第21页 |
| 1.6 发病机理 | 第21-23页 |
| 1.6.1 宿主易感性 | 第21页 |
| 1.6.2 年龄因素和品种易感性 | 第21-22页 |
| 1.6.3 受体和通路 | 第22页 |
| 1.6.4 感染和传播 | 第22页 |
| 1.6.5 潜伏期 | 第22页 |
| 1.6.6 临床过程和表现 | 第22-23页 |
| 1.6.7 组织病理学变化 | 第23页 |
| 1.6.8 发病率和死亡率 | 第23页 |
| 1.7 IBV的宿主免疫应答 | 第23-25页 |
| 1.7.1 被动免疫 | 第23页 |
| 1.7.2 先天性免疫反应 | 第23-24页 |
| 1.7.3 体液免疫 | 第24页 |
| 1.7.4 细胞免疫反应 | 第24-25页 |
| 1.7.5 粘膜免疫应答 | 第25页 |
| 1.8 IBV疫苗 | 第25-29页 |
| 1.8.1 减毒活疫苗 | 第25-26页 |
| 1.8.2 IBV灭活疫苗 | 第26页 |
| 1.8.3 病毒载体疫苗 | 第26-27页 |
| 1.8.4 亚单位疫苗、多肽疫苗和DNA疫苗 | 第27-28页 |
| 1.8.5 反向遗传操作产生的重组IBV疫苗 | 第28-29页 |
| 1.9 补体系统概述 | 第29-31页 |
| 1.10 病毒逃避补体系统的机制 | 第31-33页 |
| 1.11 本研究的目的及意义 | 第33-34页 |
| 第二章 IBVBeaudette株全长cDNA感染性克隆的构建 | 第34-51页 |
| 2.1 材料和方法 | 第34-42页 |
| 2.1.1 质粒、菌株、细胞和试剂 | 第34页 |
| 2.1.2 主要仪器和软件 | 第34-35页 |
| 2.1.3 病毒培养和RNA提取 | 第35页 |
| 2.1.4 引物设计 | 第35页 |
| 2.1.5 反转录反应 | 第35-36页 |
| 2.1.6 .IBV各片段的PCR扩增 | 第36-37页 |
| 2.1.7 IBV各片段连接载体 | 第37-38页 |
| 2.1.8 转化感受态细胞 | 第38页 |
| 2.1.9 制备IBV各片段的重组质粒 | 第38-39页 |
| 2.1.10 IBV各片段的连接及全长cDNA的获得 | 第39页 |
| 2.1.11 体外转录 | 第39-40页 |
| 2.1.12 电转IBVRNA并拯救病毒 | 第40页 |
| 2.1.13 获救病毒rIBV-P65的检测及遗传稳定性分析 | 第40-41页 |
| 2.1.14 rIBV-P65毒株间接免疫荧光试验 | 第41-42页 |
| 2.1.15 rIBV-P65毒株的复制动力学试验 | 第42页 |
| 2.2 结果 | 第42-49页 |
| 2.2.1 IBV基因组拆分的5个片段的获得 | 第42-43页 |
| 2.2.2 IBV各片段克隆至载体 | 第43-45页 |
| 2.2.3 IBV各片段的制备和连接 | 第45-46页 |
| 2.2.4 IBV全长cDNA和N基因的体外转录 | 第46-47页 |
| 2.2.5 电转染与病毒拯救 | 第47页 |
| 2.2.6 拯救病毒的检测 | 第47-48页 |
| 2.2.7 rIBV-P65病毒的遗传稳定性检测 | 第48-49页 |
| 2.2.8 rIBV-P65病毒的生长曲线的测定 | 第49页 |
| 2.3 讨论 | 第49-51页 |
| 第三章 表达H120S基因膜外区段的重组IBV的拯救及其特性分析 | 第51-60页 |
| 3.1 材料和方法 | 第51-55页 |
| 3.1.1 质粒、菌株、细胞和试剂 | 第51-52页 |
| 3.1.2 主要仪器 | 第52页 |
| 3.1.3 引物设计 | 第52-53页 |
| 3.1.4 重组病毒各基因片段的扩增及克隆入载体 | 第53-54页 |
| 3.1.5 全长cDNA的连接 | 第54页 |
| 3.1.6 重组病毒的拯救 | 第54页 |
| 3.1.7 重组病毒替换序列的检测 | 第54页 |
| 3.1.8 Western-blot法检测重组病毒的蛋白表达 | 第54页 |
| 3.1.9 各代重组病毒TCID50和EID50测定 | 第54页 |
| 3.1.10 重组IBV致鸡胚矮小化试验 | 第54-55页 |
| 3.1.11 重组IBV的免疫力评价 | 第55页 |
| 3.1.12 SPF雏鸡(3日龄)安全性试验 | 第55页 |
| 3.2 结果 | 第55-58页 |
| 3.2.1 重组病毒各基因片段的获得及全长cDNA的构建结果 | 第55页 |
| 3.2.2 重组病毒的拯救及盲传结果 | 第55-56页 |
| 3.2.3 重组病毒替换序列的完整性和遗传稳定性检测结果 | 第56页 |
| 3.2.4 Western-blot检测重组病毒N蛋白表达的结果 | 第56-57页 |
| 3.2.5 重组IBV的TCID50和EID50测定结果 | 第57页 |
| 3.2.6 致鸡胚矮小化试验 | 第57页 |
| 3.2.7 重组IBV的免疫力评价结果 | 第57-58页 |
| 3.2.8 SPF雏鸡(3日龄)安全性试验结果 | 第58页 |
| 3.3 讨论 | 第58-60页 |
| 第四章 嵌合4/91株S基因膜外区的重组IBV的构建及其特性分析 | 第60-68页 |
| 4.1 材料与方法 | 第60-64页 |
| 4.1.1 质粒、细胞和试剂 | 第60-61页 |
| 4.1.2 主要仪器 | 第61页 |
| 4.1.3 引物设计 | 第61-62页 |
| 4.1.4 重组病毒各片段的扩增及克隆入载体 | 第62页 |
| 4.1.5 重组病毒各片段的制备及全长cDNA的连接 | 第62-63页 |
| 4.1.6 体外转录及重组病毒拯救 | 第63页 |
| 4.1.7 RT-PCR法检测负链RNA | 第63页 |
| 4.1.8 Western-blot法检测病毒蛋白的表达 | 第63页 |
| 4.1.9 重组病毒的遗传稳定性检测 | 第63-64页 |
| 4.1.10 病毒滴度测定 | 第64页 |
| 4.1.11 重组IBVBeauR-4/91(S1)的免疫效力评价 | 第64页 |
| 4.1.12 SPF雏鸡(3日龄)安全性试验 | 第64页 |
| 4.2 结果 | 第64-67页 |
| 4.2.1 重组病毒基因组复制的检测 | 第64-65页 |
| 4.2.2 Western-blot法检测病毒蛋白的表达 | 第65页 |
| 4.2.3 IBV重组病毒的遗传稳定性 | 第65-66页 |
| 4.2.4 重组病毒滴度测定结果 | 第66页 |
| 4.2.5 重组IBVBeauR-4/91(S1)的免疫效力评价结果 | 第66-67页 |
| 4.2.6 SPF雏鸡(3日龄)安全性试验结果 | 第67页 |
| 4.3 讨论 | 第67-68页 |
| 第五章 CD59蛋白的并入保护IBV病毒颗粒免受补体攻击 | 第68-78页 |
| 5.1 材料与方法 | 第68-71页 |
| 5.1.1 试剂、细胞、病毒和抗体 | 第68页 |
| 5.1.2 主要仪器设备 | 第68-69页 |
| 5.1.3 蔗糖梯度离心纯化IBV病毒颗粒 | 第69页 |
| 5.1.4 Western-blot分析蔗糖梯度离心样品 | 第69页 |
| 5.1.5 病毒颗粒捕获实验 | 第69页 |
| 5.1.6 定量PCR检测IBV基因组RNA | 第69-70页 |
| 5.1.7 CD59阻断抗体和PI-PLC处理对裂解IBV病毒颗粒的影响 | 第70页 |
| 5.1.8 重组质粒pXJ40-CD59-flag的构建 | 第70页 |
| 5.1.9 IBV感染对CD59蛋白表达的影响 | 第70-71页 |
| 5.1.10 过表达、RNA干扰和酶切除对IBV释放的影响 | 第71页 |
| 5.2 结果 | 第71-76页 |
| 5.2.1 蔗糖梯度离心纯化的IBV病毒颗粒上含有CD59蛋白 | 第71页 |
| 5.2.2 CD59单抗可以捕获到IBV粒子 | 第71-72页 |
| 5.2.3 BRIC229单抗和PI-PLC以剂量依赖性方式裂解IBV | 第72-73页 |
| 5.2.4 CD59的并入保护IBV免受补体的裂解作用 | 第73页 |
| 5.2.5 补体介导的IBV裂解具有抗体的特异性 | 第73-74页 |
| 5.2.6 IBV感染可引起细胞膜上CD59的表达量减少 | 第74-75页 |
| 5.2.7 过表达CD59蛋白可增加IBV释放 | 第75页 |
| 5.2.8 敲降和切除CD59降低IBV释放 | 第75-76页 |
| 5.3 讨论 | 第76-78页 |
| 第六章 全文结论 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
| 作者简历 | 第93页 |
