| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 英文缩略词表 | 第14-15页 |
| 第一部分 文献综述 | 第15-30页 |
| 第一章 动物MSTN基因研究介绍 | 第16-18页 |
| 1. 哺乳动物GDF8基因研究历史 | 第16页 |
| 2. 水牛MSTN基因的定位及结构 | 第16页 |
| 3. 水牛MSTN基因的作用 | 第16-18页 |
| 第二章 基因编辑技术概述 | 第18-26页 |
| 1. 锌指核糖核酸酶(ZFN) | 第18-20页 |
| 1.1 锌指核糖核酸酶(ZFN)的发展历史 | 第18页 |
| 1.2 锌指核糖核酸酶(ZFN)的结构 | 第18-19页 |
| 1.3 ZFN在基因编辑中的应用 | 第19-20页 |
| 2. 转录激活样效应因子核酸酶(TALEN) | 第20-21页 |
| 2.1 TALEN的发展历史 | 第20页 |
| 2.2 TALEN的结构 | 第20-21页 |
| 2.3 TALEN在基因编辑中的应用 | 第21页 |
| 3. CRISPR/Cas9系统 | 第21-23页 |
| 3.1 CRISPR/Cas的结构 | 第21-22页 |
| 3.2 CRISPR/Cas9系统在基因编辑中的应用 | 第22-23页 |
| 3.3 CRISPR/Cas系统在人类疾病治疗中的应用 | 第23页 |
| 4. 细胞DNA损伤修复 | 第23-26页 |
| 4.1 细胞DNA损伤种类及修复途径 | 第24-25页 |
| 4.2 NHEJ修复途径 | 第25页 |
| 4.3 HR修复途径 | 第25-26页 |
| 第三章 电穿孔及其介导CRISPR/Cas9系统在哺乳动物受精卵上的研究进展 | 第26-30页 |
| 1. 电穿孔原理 | 第26页 |
| 2. 电穿孔介导CRISPR/Cas9系统在细胞上的研究 | 第26-27页 |
| 3. 电穿孔介导CRISPR/Cas9系统在哺乳动物受精卵上的研究进展 | 第27-28页 |
| 4. 展望 | 第28页 |
| 5. 研究目的与意义 | 第28-30页 |
| 第二部分 试验验研究 | 第30-75页 |
| 第一章 水牛受精卵电穿孔参数的确定 | 第31-50页 |
| 1. 前言 | 第31页 |
| 2. 实验材料 | 第31-35页 |
| 2.1 组织细胞材料 | 第31页 |
| 2.2 分子生物学相关菌株级载体 | 第31页 |
| 2.3 相关试剂 | 第31-32页 |
| 2.4 相关仪器 | 第32页 |
| 2.5 相关溶液、培养基配置 | 第32-33页 |
| 2.6 自制的四电极电穿孔槽 | 第33-35页 |
| 3. 实验方法 | 第35-39页 |
| 3.1 卵母细胞的收集 | 第35页 |
| 3.2 卵母细胞的体外成熟培养 | 第35页 |
| 3.3 卵母细胞的体外受精 | 第35页 |
| 3.4 水牛受精卵电脉冲耐受值确定 | 第35-36页 |
| 3.5 水牛受精卵发育至二细胞的电融合测试 | 第36页 |
| 3.6 体外转录EGFP mRNA | 第36-38页 |
| 3.7 电穿孔EGFP mRNA确定最佳参数值 | 第38-39页 |
| 3.8 建立实施电穿孔的方法 | 第39页 |
| 3.9 统计分析 | 第39页 |
| 4.实验结果与分析 | 第39-48页 |
| 4.1 电穿孔工具对水牛受精卵发育影响测试 | 第39-40页 |
| 4.2 薄化透明带对水牛受精卵影响 | 第40-42页 |
| 4.4 电穿孔EGFP mRNA确定最佳脉冲电压值 | 第42-43页 |
| 4.5 确定最佳的每次脉冲时间值 | 第43-44页 |
| 4.6 确定最佳的脉冲次数值 | 第44-46页 |
| 4.7 确定最佳的每次脉冲时间间隔值 | 第46-48页 |
| 5. 讨论 | 第48-49页 |
| 6. 结论 | 第49-50页 |
| 第二章 CRISPR/Cas9系统敲除活性的研究 | 第50-64页 |
| 1. 前言 | 第50页 |
| 2. 实验材料 | 第50-52页 |
| 2.1 组织细胞材料 | 第50页 |
| 2.2 分子生物学相关菌株级载体 | 第50页 |
| 2.3 相关试剂 | 第50-51页 |
| 2.4 相关仪器 | 第51页 |
| 2.5 相关溶液、培养基配置 | 第51-52页 |
| 3. 实验方法 | 第52-59页 |
| 3.1 Cas9相关载体的构建 | 第52-53页 |
| 3.2 Cas9载体质粒线性化 | 第53页 |
| 3.3 gRNA相关载体的构建 | 第53页 |
| 3.4 gRNA序列的设计 | 第53-55页 |
| 3.5 gRNA双链退火合成 | 第55-56页 |
| 3.6 RGS双荧光报告载体工作原理 | 第56页 |
| 3.7 RGS双荧光报告载体双链合成 | 第56-57页 |
| 3.8 脂质体转染293T细胞 | 第57-58页 |
| 3.9 流式细胞仪分析 | 第58页 |
| 3.10 电转染水牛BFF细胞 | 第58页 |
| 3.11 水牛BFF细胞突变检测 | 第58-59页 |
| 4. 结果与分析 | 第59-62页 |
| 4.1 Cas9载体质粒与酶切电泳验证 | 第59页 |
| 4.2 gRNA载体质粒 | 第59-60页 |
| 4.3 RGS载体质粒电泳验证 | 第60页 |
| 4.4 RGS报告系统验证Cas9系统的外源(293T细胞)切割活性 | 第60-61页 |
| 4.5 过流式细胞仪验证gRNA效率 | 第61-62页 |
| 4.6 Cas9系统在水牛BFF细胞上效率验证 | 第62页 |
| 5. 讨论 | 第62-63页 |
| 6. 结论 | 第63-64页 |
| 第三章 电穿孔导入CRISPR/Cas9系统敲除水牛受精卵MSTN基因的研究 | 第64-75页 |
| 1. 前言 | 第64页 |
| 2. 实验材料 | 第64-66页 |
| 2.1 组织细胞材料 | 第64页 |
| 2.2 分子生物学相关菌株级载体 | 第64页 |
| 2.3 相关试剂 | 第64-65页 |
| 2.4 相关仪器 | 第65页 |
| 2.5 相关溶液、培养基配置 | 第65-66页 |
| 3. 实验方法 | 第66-70页 |
| 3.1 卵母细胞的收集 | 第66-67页 |
| 3.2 卵母细胞的成熟 | 第67页 |
| 3.3 卵母细胞的体外受精 | 第67页 |
| 3.4 gRNA体外转录模板的获得 | 第67-68页 |
| 3.5 gRNA线性化模板体外转录: | 第68-69页 |
| 3.6 电穿孔导入Cas9蛋白和gRNA mRNA进水牛受精卵 | 第69页 |
| 3.7 水牛受精卵收集与T7E1酶切基因检测 | 第69-70页 |
| 4. 结果与分析 | 第70-74页 |
| 4.1 体外转录模板准备 | 第70页 |
| 4.2 体外转录的gRNA电泳验证 | 第70-71页 |
| 4.3 电穿孔导入Cas9蛋白和单条gRNA进水牛受精卵 | 第71-73页 |
| 4.4 电穿孔导入Cas9蛋白和3条混合gRNA进水牛受精卵 | 第73-74页 |
| 5. 讨论 | 第74页 |
| 6. 结论 | 第74-75页 |
| 论文总结论 | 第75-77页 |
| 参考文献 | 第77-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 攻读学位期间发表论文及专利 | 第82页 |
