| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 主要符号对照表 | 第11-13页 |
| 第1章 前言 | 第13-32页 |
| 1.1 本章引论 | 第13-14页 |
| 1.2 冠状病毒研究历史 | 第14-15页 |
| 1.3 冠状病毒的分类 | 第15-16页 |
| 1.4 冠状病毒的形状、组成和基因组结构 | 第16-18页 |
| 1.5 冠状病毒的宿主和跨种传播 | 第18-20页 |
| 1.6 冠状病毒的 S 蛋白与膜融合机制 | 第20-21页 |
| 1.7 冠状病毒受体识别 | 第21-28页 |
| 1.7.1 SARS-CoV 与受体 ACE2 的结合方式 | 第22-23页 |
| 1.7.2 NL63-CoV 与受体 ACE2 的结合方式 | 第23-25页 |
| 1.7.3 PRCV 与受体 APN 的结合方式 | 第25-26页 |
| 1.7.4 MHV 与受体 CEACAM1a 的结合方式 | 第26-28页 |
| 1.8 MERS-COV 研究进展 | 第28-31页 |
| 1.9 本论文的研究目的 | 第31-32页 |
| 第2章 MERS-CoV 受体结合区（RBD）的鉴定 | 第32-48页 |
| 2.1 本章引论 | 第32-35页 |
| 2.1.1 实验背景 | 第32-33页 |
| 2.1.2 原理概述 | 第33-34页 |
| 2.1.3 流程设计 | 第34-35页 |
| 2.2 实验材料 | 第35-37页 |
| 2.2.1 实验试剂 | 第35-36页 |
| 2.2.2 实验仪器 | 第36-37页 |
| 2.2.3 相关基因的获取 | 第37页 |
| 2.2.4 克隆与表达载体 | 第37页 |
| 2.3 实验方法 | 第37-42页 |
| 2.3.1 引物设计 | 第37-40页 |
| 2.3.2 S1 各片段的克隆构建 | 第40页 |
| 2.3.3 DPP4 的克隆构建 | 第40页 |
| 2.3.4 转化 DH10Bac 感受态细胞 | 第40-41页 |
| 2.3.5 Bacmid 的提取 | 第41页 |
| 2.3.6 杆状病毒的制备和扩增 | 第41-42页 |
| 2.3.7 通过共表达和 Pull-down 实验确定 RBD | 第42页 |
| 2.4 结果与分析 | 第42-46页 |
| 2.4.1 S 蛋白片段和 DPP4 的克隆构建结果 | 第42-45页 |
| 2.4.2 提取 Bacmid 的实验结果 | 第45页 |
| 2.4.3 Pull-down 实验结果 | 第45-46页 |
| 2.5 小结与讨论 | 第46-48页 |
| 第3章 RBD-DPP4 复合物的制备及结构解析 | 第48-62页 |
| 3.1 本章引论 | 第48-50页 |
| 3.1.1 实验背景 | 第48页 |
| 3.1.2 原理概述 | 第48-49页 |
| 3.1.3 流程设计 | 第49-50页 |
| 3.2 实验材料 | 第50-51页 |
| 3.2.1 结晶条件筛选试剂盒 | 第50页 |
| 3.2.2 主要实验仪器 | 第50-51页 |
| 3.3 实验方法 | 第51-53页 |
| 3.3.1 蛋白的表达、收集与亲和纯化 | 第51页 |
| 3.3.2 RBD-L、RBD-S 的进一步纯化 | 第51页 |
| 3.3.3 DPP4-His 蛋白的进一步纯化 | 第51-52页 |
| 3.3.4 复合物的制备 | 第52页 |
| 3.3.5 晶体筛选与获得 | 第52-53页 |
| 3.3.6 衍射数据收集与结构解析 | 第53页 |
| 3.4 结果与分析 | 第53-60页 |
| 3.4.1 RBD-S 的纯化结果 | 第53-54页 |
| 3.4.2 RBD-L 的纯化结果 | 第54-55页 |
| 3.4.3 DPP4-His 纯化结果 | 第55-57页 |
| 3.4.4 晶体筛选结果 | 第57-58页 |
| 3.4.5 衍射数据的收集与数据粗处理 | 第58-59页 |
| 3.4.6 晶体结构的解析 | 第59-60页 |
| 3.5 小结与讨论 | 第60-62页 |
| 第4章 RBD-DPP4 复合物晶体结构分析 | 第62-72页 |
| 4.1 本章引论 | 第62页 |
| 4.2 复合物整体结构 | 第62-64页 |
| 4.3 结合面的形状和电荷互补 | 第64-65页 |
| 4.4 RBD 的结合对 DPP4 结构和功能的影响 | 第65页 |
| 4.5 MERS-COV RBD 与 SARS-COV RBD 的结构比较 | 第65-68页 |
| 4.6 结合区的氨基酸相互作用分析 | 第68-70页 |
| 4.7 小结与讨论 | 第70-72页 |
| 第5章 RBD 关键氨基酸突变对受体结合及假病毒侵染的影响 | 第72-81页 |
| 5.1 本章引论 | 第72-73页 |
| 5.1.1 实验背景 | 第72页 |
| 5.1.2 原理概述 | 第72-73页 |
| 5.1.3 流程设计 | 第73页 |
| 5.2 实验材料 | 第73-74页 |
| 5.3 实验方法 | 第74-76页 |
| 5.3.1 突变体克隆构建 | 第74-75页 |
| 5.3.2 Pull-down 实验 | 第75页 |
| 5.3.3 假病毒制备与侵染实验 | 第75-76页 |
| 5.4 结果与分析 | 第76-79页 |
| 5.4.1 突变体克隆的构建结果 | 第76页 |
| 5.4.2 Pull-down 实验结果 | 第76-77页 |
| 5.4.3 MERS-CoV 假病毒对受体细胞的选择 | 第77-78页 |
| 5.4.4 Spike 突变体构建的假病毒对 Huh-7 细胞的侵染情况 | 第78-79页 |
| 5.4.5 RBD 上关键氨基酸位点的进一步确认 | 第79页 |
| 5.5 小结与讨论 | 第79-81页 |
| 第6章 DPP4 关键氨基酸突变对 RBD 结合及假病毒侵染的影响 | 第81-93页 |
| 6.1 本章引论 | 第81-83页 |
| 6.1.1 实验背景 | 第81页 |
| 6.1.2 原理概述 | 第81-82页 |
| 6.1.3 流程设计 | 第82-83页 |
| 6.2 实验材料 | 第83页 |
| 6.3 实验方法 | 第83-85页 |
| 6.3.1 突变体的克隆构建 | 第83-84页 |
| 6.3.2 DPP4 胞外区突变体的表达与纯化 | 第84页 |
| 6.3.3 SPR 实验 | 第84页 |
| 6.3.4 本章假病毒侵染实验方法 | 第84-85页 |
| 6.4 结果与分析 | 第85-91页 |
| 6.4.1 克隆构建与 DPP4 胞外区突变体的表达、纯化 | 第85-86页 |
| 6.4.2 SPR 实验结果 | 第86-88页 |
| 6.4.3 假病毒侵染实验结果 | 第88-89页 |
| 6.4.4 DPP4 上关键氨基酸位点的进一步确认 | 第89-90页 |
| 6.4.5 DPP4 上的关键氨基酸位点在不同物种中的差异分析 | 第90-91页 |
| 6.5 小结与讨论 | 第91-93页 |
| 第7章 RBD 特异性中和抗体的筛选与结晶尝试 | 第93-108页 |
| 7.1 本章引论 | 第93-98页 |
| 7.1.1 实验背景 | 第93-95页 |
| 7.1.2 原理概述 | 第95-97页 |
| 7.1.3 流程设计 | 第97-98页 |
| 7.2 实验材料 | 第98-99页 |
| 7.3 实验方法 | 第99-102页 |
| 7.3.1 制备生物素标记的 RBD 蛋白 | 第99-100页 |
| 7.3.2 中和抗体的筛选 | 第100页 |
| 7.3.4 抗体的全长表达与纯化 | 第100-101页 |
| 7.3.5 酶切抗体获取 Fab 片段 | 第101页 |
| 7.3.6 反挂 Protein A beads 分离 Fab | 第101页 |
| 7.3.7 DEAE-Sepharose Beads 分离 Fab | 第101页 |
| 7.3.8 抗体-RBD 复合物的制备与结晶尝试 | 第101-102页 |
| 7.4 结果与分析 | 第102-106页 |
| 7.4.1 RBD-L-Biotag 和 RBD-S-Biotag 的表达分析 | 第102页 |
| 7.4.2 RBD-S-Biotag 生物素标记结果 | 第102-103页 |
| 7.4.3 MERS-4 和 MERS-27 的表达与酶切 | 第103-104页 |
| 7.4.4 Fab 片段的纯化 | 第104-105页 |
| 7.4.5 Fab-RBD 复合物的制备与晶体生长 | 第105-106页 |
| 7.5 小结与讨论 | 第106-108页 |
| 第8章 总结与展望 | 第108-115页 |
| 8.1 本文的主要研究内容 | 第108页 |
| 8.2 本文的研究意义 | 第108-109页 |
| 8.3 研究展望 | 第109-115页 |
| 8.3.1 冠状病毒的结构生物学研究 | 第109页 |
| 8.3.2 针对 MERS-CoV S 蛋白的药物设计 | 第109-111页 |
| 8.3.3 单克隆抗体用于治疗 | 第111页 |
| 8.3.4 结构指导的疫苗设计 | 第111-113页 |
| 8.3.5 针对 S 蛋白其他部分的疫苗设计 | 第113页 |
| 8.3.6 对未来传染病研究的启示 | 第113-115页 |
| 参考文献 | 第115-123页 |
| 致谢 | 第123-125页 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第125页 |
