| 摘要 | 第4-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-29页 |
| 1.1 植物RNA沉默与病毒编码的沉默抑制子 | 第14-18页 |
| 1.1.1 植物的RNA沉默 | 第14-16页 |
| 1.1.2 植物病毒编码的RNA沉默抑制子 | 第16-18页 |
| 1.2 植物抗病反应 | 第18-21页 |
| 1.3 马铃薯X病毒 | 第21-23页 |
| 1.4 水稻条纹病毒 | 第23-28页 |
| 1.4.1 水稻条纹病毒的危害 | 第23页 |
| 1.4.2 RSV的分子生物学 | 第23-27页 |
| 1.4.3 水稻条纹病毒基因间隔区 | 第27-28页 |
| 1.5 目的与意义 | 第28-29页 |
| 第二章 烟草蛋白酶抑制荆基因参与寄主抗PVX侵染 | 第29-57页 |
| 2.1 材料与方法 | 第30-43页 |
| 2.1.1 供试植物 | 第30页 |
| 2.1.2 菌株及克隆载体 | 第30页 |
| 2.1.3 酵母双杂交筛库 | 第30-34页 |
| 2.1.3.1 载体构建及本氏烟cDNA文库构建 | 第30页 |
| 2.1.3.2 本氏烟文库构建 | 第30-32页 |
| 2.1.3.3 酵母感受态细胞制备(LiAc法) | 第32-33页 |
| 2.1.3.4 本氏烟dscDNA和pGADT7-Rec共转化酵母菌株AH109 | 第33页 |
| 2.1.3.5 互作蛋白筛选及测序 | 第33-34页 |
| 2.1.4 载体构建 | 第34-35页 |
| 2.1.5 制备抗血清 | 第35-37页 |
| 2.1.5.1 转化原核表达菌株BL21pLysS | 第35页 |
| 2.1.5.2 诱导表达 | 第35页 |
| 2.1.5.3 SDS-PAGE检测 | 第35页 |
| 2.1.5.4 目的蛋白纯化 | 第35-36页 |
| 2.1.5.5 抗血清制备 | 第36-37页 |
| 2.1.6 双分子荧光互补验证互作 | 第37-38页 |
| 2.1.6.1 农杆菌感受态细胞制备 | 第37页 |
| 2.1.6.2 电击转化 | 第37页 |
| 2.1.6.3 菌液制备 | 第37页 |
| 2.1.6.4 浸润烟草组织及共聚焦显微观察 | 第37-38页 |
| 2.1.7 NbPI蛋白定位观察 | 第38页 |
| 2.1.8 VIGS分析 | 第38页 |
| 2.1.9 NbPI过表达分析 | 第38-40页 |
| 2.1.9.1 NbPI局部过表达 | 第38页 |
| 2.1.9.2 病毒载体介导NbPI系统过表达 | 第38-39页 |
| 2.1.9.3 遗传转化介导NbPI系统过表达 | 第39-40页 |
| 2.1.10 NbPI影响p25功能分析 | 第40页 |
| 2.1.10.1 NbPI影响p25沉默抑制子功能检测 | 第40页 |
| 2.1.10.2 NbPI影响p25运动功能检测 | 第40页 |
| 2.1.11 转基因烟草DNA提取 | 第40-41页 |
| 2.1.12 Northern blot检测 | 第41-42页 |
| 2.1.13 Western blot检测 | 第42-43页 |
| 2.2 实验结果 | 第43-55页 |
| 2.2.1 从本氏烟cDNAs克隆到NbPI基因全长 | 第43-44页 |
| 2.2.2 NbPI全长克隆、序列分析、定位分析与抗血清制备 | 第44-46页 |
| 2.2.2.1 NbPI全长克隆、序列分析及组织表达特异性 | 第44-45页 |
| 2.2.2.2 NbPI的亚细胞定位 | 第45页 |
| 2.2.2.3 NnpI原核表达及抗血清制备 | 第45-46页 |
| 2.2.3 PVX介导NbPI沉默后,病毒症状加强,病毒积累量增加 | 第46-48页 |
| 2.2.4 NbPI过表达后,病毒症状减轻,病毒含量减少 | 第48-52页 |
| 2.2.5 NbPI影响PVX p25的沉默抑制子功能 | 第52-53页 |
| 2.2.6 NbPI影响PVX p25的运动功能 | 第53-54页 |
| 2.2.7 PVX诱导NbPI表达下调 | 第54-55页 |
| 2.3 讨论 | 第55-57页 |
| 第三章 水稻条纹病毒P3蛋白诱导水稻抗病性研究 | 第57-84页 |
| 3.1 材料与方法 | 第57-70页 |
| 3.1.1 植物材料与病毒来源 | 第57-58页 |
| 3.1.2 供试菌株与质粒载体 | 第58页 |
| 3.1.3 植物总RNA提取(Trizol法) | 第58页 |
| 3.1.4 cDNA合成 | 第58-59页 |
| 3.1.5 T-载体构建 | 第59-61页 |
| 3.1.5.1 基因的扩增 | 第59页 |
| 3.1.5.2 DNA片段的切胶回收 | 第59-60页 |
| 3.1.5.3 目的片段的T-连接与转化 | 第60页 |
| 3.1.5.4 阳性克隆的鉴定 | 第60-61页 |
| 3.1.5.5 质粒抽提 | 第61页 |
| 3.1.6 转化载体构建 | 第61-62页 |
| 3.1.6.1 酶切及产物回收 | 第61-62页 |
| 3.1.6.2 连接 | 第62页 |
| 3.1.6.3 转化、阳性克隆筛选和质粒抽提 | 第62页 |
| 3.1.7 农杆菌介导的遗传转化 | 第62-63页 |
| 3.1.7.1 水稻成熟胚遗传转化 | 第62-63页 |
| 3.1.7.2 烟草遗传转化—叶盘法 | 第63页 |
| 3.1.8 转基因再生植株的分子生物学检测 | 第63-64页 |
| 3.1.8.1 转基因植株DNA检测 | 第63页 |
| 3.1.8.2 转基因植株RT-PCR检测 | 第63-64页 |
| 3.1.8.3 转基因植株Northern blot检测 | 第64页 |
| 3.1.9 芯片检测及结果验证 | 第64-68页 |
| 3.1.9.1 芯片检测 | 第64页 |
| 3.1.9.2 实时定量PCR检测芯片结果 | 第64-68页 |
| 3.1.10 接RSV检验 | 第68页 |
| 3.1.11 病毒含量检测 | 第68-69页 |
| 3.1.12 转基因接种白叶枯菌 | 第69页 |
| 3.1.13 转基因水稻接种稻瘟菌 | 第69-70页 |
| 3.2 实验结果 | 第70-81页 |
| 3.2.1 遗传转化水稻再生苗获得 | 第70-72页 |
| 3.2.2 转p3水稻表型观察 | 第72页 |
| 3.2.3 RSV p3基因影响水稻内源microRNA表达 | 第72-74页 |
| 3.2.4 RSV p3基因影响水稻内源mRNA表达 | 第74-75页 |
| 3.2.5 转p3水稻早期对RSV侵染敏感,后期症状缓和 | 第75-77页 |
| 3.2.6 在p3转基因植株中PR与NBS-LRR基因发生表达上调 | 第77-78页 |
| 3.2.7 转p3基因增强水稻对水稻白叶枯病抗病能力 | 第78-79页 |
| 3.2.8 转p3基因增强水稻对稻瘟病抗病能力 | 第79-80页 |
| 3.2.9 转p3基因水稻增强的抗性可能不依赖SA与JA途径 | 第80页 |
| 3.2.10 转p3基因烟草增加烟草抗水稻条纹叶枯病能力 | 第80-81页 |
| 3.3 讨论 | 第81-84页 |
| 第四章 水稻条纹病毒基因组转录终止位点分析 | 第84-94页 |
| 4.1 材料与方法 | 第85-86页 |
| 4.1.1 寄主植物及昆虫介体 | 第85页 |
| 4.1.2 RNA抽提 | 第85页 |
| 4.1.3 Northern blot | 第85-86页 |
| 4.1.4 RSV转录本3’-RACE实验 | 第86页 |
| 4.1.5 纤细病毒属序列及序列分析 | 第86页 |
| 4.1.6 RNA二级结构预测 | 第86页 |
| 4.2 实验结果 | 第86-91页 |
| 4.2.1 RSV RNA1转录本在序列末端终止 | 第86-87页 |
| 4.2.2 RSV RNA2转录本转录终止位点确定 | 第87-88页 |
| 4.2.3 RSV RNA3转录终止位点 | 第88页 |
| 4.2.4 RSV RNA4转录本转录终止位点 | 第88-89页 |
| 4.2.5 AUCCGGAU是纤细病毒属RNA保守序列 | 第89-90页 |
| 4.2.6 转录终止位点所在的二级结构预测 | 第90-91页 |
| 4.3 讨论 | 第91-94页 |
| 第五章 本文总结及创新点 | 第94-97页 |
| 5.1 结论 | 第94-95页 |
| 5.1.1 烟草蛋白酶抑制剂基因参与寄主抗PVX侵染 | 第94页 |
| 5.1.2 RSV p3基因诱导水稻抗病性 | 第94-95页 |
| 5.1.3 水稻条纹病毒RNA2和RNA4在AUCCGGAU位置转录终止 | 第95页 |
| 5.2 展望 | 第95页 |
| 5.2.1 NbPI与p25互作分析 | 第95页 |
| 5.2.2 RSV p3基因表达增强寄主抗性 | 第95页 |
| 5.3 创新点 | 第95-97页 |
| 参考文献 | 第97-110页 |
| 附A：英文缩略表 | 第110-112页 |
| 附B：研究中用的培养基及缓冲液配制 | 第112-116页 |
| 致谢 | 第116-117页 |
| 作者简介 | 第117页 |
