| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-10页 |
| 第一章 前言 | 第15-31页 |
| 1.1 海藻糖与海藻酮糖理化特性与生物功能 | 第15-17页 |
| 1.2 海藻糖与海藻酮糖的生产方法 | 第17-19页 |
| 1.3 海藻糖合成酶的研究进展 | 第19-26页 |
| 1.3.1 海藻糖合成酶分子结构与催化机制 | 第19-24页 |
| 1.3.2 海藻糖合成酶转化率分析 | 第24-25页 |
| 1.3.3 海藻糖合成酶底物特异性分析 | 第25-26页 |
| 1.4 酶分子改造的研究进展 | 第26-29页 |
| 1.4.1 理性设计(rational design) | 第26-27页 |
| 1.4.2 非理性设计(irrational design) | 第27页 |
| 1.4.3 半理性设计(semi-rational design) | 第27-28页 |
| 1.4.4 海藻糖合成酶的人工改造 | 第28-29页 |
| 1.5 立题依据与研究内容 | 第29-30页 |
| 1.6 技术路线 | 第30-31页 |
| 第二章 材料与方法 | 第31-52页 |
| 2.1 材料 | 第31-33页 |
| 2.1.1 菌株及质粒 | 第31页 |
| 2.1.2 酶与试剂 | 第31-32页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第32页 |
| 2.1.4 培养基 | 第32-33页 |
| 2.2 实验方法 | 第33-52页 |
| 2.2.1 细菌的培养 | 第33页 |
| 2.2.2 菌株保存 | 第33页 |
| 2.2.3 细菌总DNA的提取 | 第33-34页 |
| 2.2.4 质粒DNA的少量提取 | 第34页 |
| 2.2.5 DNA的检测方法 | 第34页 |
| 2.2.6 海藻糖合成酶基因的引物设计与扩增 | 第34-36页 |
| 2.2.7 表达载体pSE380的制备 | 第36-37页 |
| 2.2.8 DNA分子的酶切与连接 | 第37-38页 |
| 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第38页 |
| 2.2.10 质粒DNA或者连接产物的转化 | 第38页 |
| 2.2.11 海藻糖合成酶基因表达载体的构建 | 第38-39页 |
| 2.2.12 海藻糖合成酶基因的诱导表达 | 第39页 |
| 2.2.13 表达产物的镍柱亲合层析Ni-NTA纯化 | 第39页 |
| 2.2.14 镍柱亲合层析Ni-NTA介质的活化 | 第39页 |
| 2.2.15 细胞破碎与表达产物的纯化 | 第39-40页 |
| 2.2.16 蛋白含量测定与SDS-PAGE和Native-PAGE分析 | 第40-41页 |
| 2.2.17 海藻糖合成酶酶活力的测定 | 第41页 |
| 2.2.18 海藻糖合成酶酶学特性分析 | 第41-42页 |
| 2.2.19 HPLC法分析海藻糖合成酶酶学特性 | 第42-43页 |
| 2.2.20 DNS法快速检验海藻糖合成酶酶学特性 | 第43-44页 |
| 2.2.21 底物浓度对产物组成的影响 | 第44页 |
| 2.2.22 海藻糖合成酶半理性设计 | 第44页 |
| 2.2.23 海藻糖合成酶同源建模 | 第44页 |
| 2.2.24 海藻糖合成酶突变体构建 | 第44-47页 |
| 2.2.25 突变子性质检测 | 第47页 |
| 2.2.26 ProSa2003能量分析 | 第47页 |
| 2.2.27 分子对接与底物通道计算 | 第47-48页 |
| 2.2.28 海藻糖合成酶非理性设计 | 第48-49页 |
| 2.2.29 突变文库的构建与筛选 | 第49-50页 |
| 2.2.30 生成海藻酮糖用酶与酿酒酵母细胞的制备 | 第50页 |
| 2.2.31 离子交换填料预处理 | 第50页 |
| 2.2.32 海藻酮糖的生成与纯化 | 第50-52页 |
| 第三章 结果与分析 | 第52-99页 |
| 3.1 海藻糖合成酶基因的克隆、表达及酶学特性研究 | 第52-74页 |
| 3.1.1 SCTreS、TCTreS、SATreS和SGTreS基因的克隆、表达 | 第52-60页 |
| 3.1.2 SCTreS、TCTreS、SATreS和SGTreS酶学性质研究 | 第60-74页 |
| 3.2 海藻糖合成酶功能氨基酸残基分析 | 第74-95页 |
| 3.2.1 SATreS氨基酸序列(500 APSTGGNG 507)的缺失突变与性质比对 | 第74页 |
| 3.2.2 TCTreS碳末端40个氨基酸缺失突变与性质比较 | 第74-75页 |
| 3.2.3 TCTreS同源建模与结构分析 | 第75-76页 |
| 3.2.4 TCTreS 3D结构活性中心氨基酸分析 | 第76-78页 |
| 3.2.5 TCTreS突变体构建与酶学性质分析 | 第78-80页 |
| 3.2.6 TCTreS L116位点的饱和突变 | 第80页 |
| 3.2.7 TCTreS E330位点的饱和突变 | 第80-81页 |
| 3.2.8 TCTreS活性中心10 A范围内的定点突变与酶学特性分析 | 第81-82页 |
| 3.2.9 TCTreS V160位点的饱和突变 | 第82-83页 |
| 3.2.10 TCTreS功能氨基酸残基的分布与活性中心的关系 | 第83-84页 |
| 3.2.11 海藻糖合成酶及其突变体的能量分析 | 第84-86页 |
| 3.2.12 CGTreS的Ⅰ区和Ⅱ区能量最小化突变 | 第86-88页 |
| 3.2.13 功能氨基酸残基机制分析 | 第88-90页 |
| 3.2.14 TCTreS 3D结构与底物对接及底物通道计算 | 第90-94页 |
| 3.2.15 海藻糖合成酶非理性设计探讨 | 第94-95页 |
| 3.3 海藻酮糖的制备研究 | 第95-99页 |
| 3.3.1 GTase催化蔗糖生成海藻酮糖 | 第95-97页 |
| 3.3.2 酿酒酵母细胞同化杂糖 | 第97-99页 |
| 第四章 问题和展望 | 第99-104页 |
| 4.1 海藻糖合成酶基因的多样性 | 第99-100页 |
| 4.2 海藻糖合成酶的高级结构与稳定性 | 第100-101页 |
| 4.3 海藻糖合成酶在生产海藻酮糖中的应用 | 第101-102页 |
| 4.4 海藻糖合成酶功能氨基酸残基研究的策略 | 第102-104页 |
| 第五章 结论 | 第104-106页 |
| 第六章 参考文献 | 第106-122页 |
| 附录 | 第122-133页 |
| 附录一 培养基与常用试剂 | 第122-124页 |
| 附录二 部分实验方法 | 第124-127页 |
| 附录三 部分实验结果 | 第127-133页 |
| 致谢 | 第133-134页 |
| 攻读学位期间所发表的学术论文和研究成果 | 第134-135页 |
