| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 缩略语表 | 第12-13页 |
| 1 前言 | 第13-26页 |
| 1.1 香菇概述 | 第13-14页 |
| 1.2 香菇内源型甲醛的研究 | 第14-16页 |
| 1.2.1 香菇甲醛形成机理 | 第14-15页 |
| 1.2.2 香菇甲醛存在规律 | 第15-16页 |
| 1.3 γ-谷氨酰转肽酶的研究 | 第16-18页 |
| 1.3.1 γ-谷氨酰转肽酶概述 | 第16页 |
| 1.3.2 GGT的序列和结构 | 第16-17页 |
| 1.3.3 GGT的酶学性质 | 第17-18页 |
| 1.4 RACE技术及其原理 | 第18-21页 |
| 1.4.1 RACE简介 | 第18-19页 |
| 1.4.2 3’RACE反应 | 第19页 |
| 1.4.3 5’RACE反应 | 第19-20页 |
| 1.4.4 RACE技术在基因研究中的应用 | 第20-21页 |
| 1.5 毕赤酵母表达系统 | 第21-25页 |
| 1.5.1 毕赤酵母宿主菌株 | 第21-22页 |
| 1.5.2 毕赤酵母表达载体 | 第22-23页 |
| 1.5.3 毕赤酵母甲醇利用型 | 第23页 |
| 1.5.4 外源基因转化毕赤酵母 | 第23-25页 |
| 1.6 本研究的目的和意义 | 第25-26页 |
| 2 材料与方法 | 第26-51页 |
| 2.1 试验材料 | 第26-27页 |
| 2.1.1 供试菌株和载体 | 第26页 |
| 2.1.2 酶与试剂盒 | 第26页 |
| 2.1.3 其它试剂 | 第26页 |
| 2.1.4 常用仪器 | 第26-27页 |
| 2.1.5 培养基 | 第27页 |
| 2.2 试验方法 | 第27-29页 |
| 2.2.1 香菇子实体RNA提取及反转录 | 第27-28页 |
| 2.2.2 RNA检测 | 第28页 |
| 2.2.3 除去RNA中的DNA | 第28-29页 |
| 2.3 香菇GGT cDNA特异性序列的获得 | 第29-33页 |
| 2.3.1 反转录合成cDNA第一链 | 第29-31页 |
| 2.3.2 PCR体系与程序 | 第31页 |
| 2.3.3 香菇GGT cDNA特异性序列电泳检测 | 第31页 |
| 2.3.4 PCR产物切胶回收 | 第31-32页 |
| 2.3.5 香菇GGT cDNA特异性序列的T-A克隆和测序 | 第32-33页 |
| 2.3.6 香菇GGT cDNA特异性序列测序结果的同源性分析 | 第33页 |
| 2.3.7 香菇GGT cDNA特异性序列测序结果CDS分析 | 第33页 |
| 2.4 香菇GGT cDNA 3’末端序列扩增 | 第33-36页 |
| 2.4.1 反转录反应 | 第33-34页 |
| 2.4.2 巢式PCR反应 | 第34-35页 |
| 2.4.3 琼脂糖凝胶电泳检测 | 第35页 |
| 2.4.4 香菇GGT cDNA 3’末端序列PCR产物切胶回收 | 第35页 |
| 2.4.5 香菇GGT cDNA 3’末端序列PCR产物T-A克隆与测序 | 第35-36页 |
| 2.5 香菇GGT cDNA 5’末端序列扩增 | 第36-41页 |
| 2.5.1 去磷酸化处理 | 第36-37页 |
| 2.5.2 “去帽子”反应 | 第37页 |
| 2.5.3 5’RACE Adaptor的连接 | 第37-38页 |
| 2.5.4 反转录反应 | 第38-39页 |
| 2.5.5 Outer PCR反应 | 第39-40页 |
| 2.5.6 Inner PCR反应 | 第40页 |
| 2.5.7 琼脂糖凝胶电泳 | 第40页 |
| 2.5.8 香菇GGT cDNA 3’末端序列PCR产物切胶回收 | 第40页 |
| 2.5.9 香菇GGT cDNA 3’末端序列PCR产物T-A克隆与测序 | 第40-41页 |
| 2.5.10 香菇GGT全长cDNA序列的拼接 | 第41页 |
| 2.6 香菇GGT的生物信息学分析 | 第41-42页 |
| 2.6.1 香菇GGT ORF及氨基酸序列预测 | 第41页 |
| 2.6.2 香菇GGT的氨基酸组成及理化性质分析 | 第41页 |
| 2.6.3 香菇GGT信号肽预测 | 第41页 |
| 2.6.4 香菇GGT糖基化位点预测 | 第41页 |
| 2.6.5 香菇GGT磷酸化位点预测 | 第41-42页 |
| 2.6.6 香菇GGT亲水/疏水性分析 | 第42页 |
| 2.6.7 不同物种GGT的氨基酸序列同源性对比 | 第42页 |
| 2.7 大肠杆菌表达载体和香菇GGT大肠杆菌工程菌的构建 | 第42-46页 |
| 2.7.1 香菇GGT基因的PCR扩增及产物回收测序 | 第42-43页 |
| 2.7.2 大肠杆菌重组表达载体的构建 | 第43-44页 |
| 2.7.3 香菇GGT大肠杆菌工程菌的构建 | 第44页 |
| 2.7.4 重组GGT的诱导表达和纯化 | 第44-46页 |
| 2.8 毕赤酵母表达载体和香菇GGT毕赤酵母工程菌的构建 | 第46-51页 |
| 2.8.1 香菇GGT基因的PCR扩增及产物回收测序 | 第46-47页 |
| 2.8.2 毕赤酵母重组表达载体的构建 | 第47-48页 |
| 2.8.3 香菇GGT毕赤酵母工程菌的构建 | 第48-49页 |
| 2.8.4 重组GGT的表达 | 第49-51页 |
| 3 结果与分析 | 第51-71页 |
| 3.1 香菇子实体RNA提取及反转录 | 第51-52页 |
| 3.1.1 RNA提取及质量检测 | 第51页 |
| 3.1.2 除去RNA中的DNA | 第51-52页 |
| 3.2 香菇GGT cDNA特异性序列的获得 | 第52-54页 |
| 3.2.1 香菇GGT cDNA特异性序列PCR及测序结果 | 第52-53页 |
| 3.2.2 香菇GGT特异性cDNA特异性序列同源性分析 | 第53页 |
| 3.2.3 香菇GGT cDNA特异性序列测序结果CDS分析 | 第53-54页 |
| 3.3 香菇GGT cDNA 3’末端序列扩增 | 第54-55页 |
| 3.3.1 香菇GGT cDNA 3’末端PCR结果 | 第54页 |
| 3.3.2 香菇GGT cDNA 3’末端测序结果 | 第54-55页 |
| 3.4 香菇GGT cDNA 5’末端扩增 | 第55页 |
| 3.4.1 香菇GGT cDNA 5’末端PCR结果 | 第55页 |
| 3.5 香菇GGT全长cDNA序列的拼接 | 第55-56页 |
| 3.6 香菇GGT的生物信息学分析 | 第56-61页 |
| 3.6.1 香菇GGT ORF及氨基酸序列预测 | 第56页 |
| 3.6.2 香菇GGT的氨基酸组成及理化性质分析 | 第56-57页 |
| 3.6.3 香菇GGT信号肽预测 | 第57-58页 |
| 3.6.4 香菇GGT糖基化位点预测 | 第58页 |
| 3.6.5 香菇GGT磷酸化位点预测 | 第58-59页 |
| 3.6.6 香菇GGT亲水/疏水性分析 | 第59页 |
| 3.6.7 不同物种GGT的氨基酸序列同源性对比 | 第59-61页 |
| 3.7 大肠杆菌表达载体和香菇GGT大肠杆菌工程菌的构建 | 第61-66页 |
| 3.7.1 香菇GGT基因的PCR扩增及产物回收测序 | 第61页 |
| 3.7.2 大肠杆菌重组表达载体的构建 | 第61-62页 |
| 3.7.3 香菇GGT大肠杆菌工程菌的构建 | 第62-63页 |
| 3.7.4 重组GGT的诱导表达和纯化 | 第63-66页 |
| 3.8 毕赤酵母表达载体和香菇GGT毕赤酵母工程菌的构建 | 第66-71页 |
| 3.8.1 香菇GGT基因的PCR扩增及产物回收测序 | 第66页 |
| 3.8.2 毕赤酵母重组表达载体的构建 | 第66-68页 |
| 3.8.3 香菇GGT毕赤酵母工程菌的构建 | 第68-70页 |
| 3.8.4 重组GGT的表达 | 第70-71页 |
| 4 总结与讨论 | 第71-75页 |
| 4.1 总结 | 第71-72页 |
| 4.2 讨论 | 第72-75页 |
| 4.2.1 香菇GGT全长cDNA序列的克隆 | 第72-73页 |
| 4.2.2 大肠杆菌表达载体和香菇GGT大肠杆菌工程菌的构建 | 第73页 |
| 4.2.3 毕赤酵母表达载体和香菇GGT毕赤酵母工程菌的构建 | 第73-75页 |
| 参考文献 | 第75-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 附录一 RNA提取系列试剂 | 第82-83页 |
| 附录二 香菇GGT cDNA特异性序列 | 第83-84页 |
| 附录三 香菇GGT 3’末端序列 | 第84-85页 |
| 附录四 香菇GGT 5’末端序列 | 第85-86页 |
| 附录五 香菇GGT cDNA全长序列 | 第86-88页 |
| 附录六 重组GGT纯化相关试剂配制 | 第88页 |
