| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 前言 | 第14-26页 |
| 1.1 海洋微生物 | 第14-16页 |
| 1.1.1 海洋微生物的多样性 | 第14-15页 |
| 1.1.2 海洋微生物的研究进展 | 第15-16页 |
| 1.2 蛋白酶 | 第16-17页 |
| 1.3 碱性蛋白酶 | 第17-22页 |
| 1.3.1 碱性蛋白酶的简介 | 第17-18页 |
| 1.3.2 碱性蛋白酶的发酵工艺 | 第18-20页 |
| 1.3.3 碱性蛋白酶的应用 | 第20-22页 |
| 1.4 海洋微生物碱性蛋白酶的研究进展 | 第22-24页 |
| 1.4.1 国外对海洋微生物碱性蛋白酶的研究进展 | 第22-23页 |
| 1.4.2 国内对海洋微生物碱性蛋白酶的研究进展 | 第23-24页 |
| 1.5 课题研究目的及意义 | 第24-25页 |
| 1.6 实验技术路线 | 第25-26页 |
| 第二章 材料与方法 | 第26-48页 |
| 2.1 实验材料 | 第26-31页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第26-27页 |
| 2.1.2 样品来源 | 第27页 |
| 2.1.3 主要酶与化学试剂 | 第27页 |
| 2.1.4 主要仪器和设备 | 第27-28页 |
| 2.1.5 培养基 | 第28-29页 |
| 2.1.6 常用溶液 | 第29-30页 |
| 2.1.7 常用抗生素及浓度 | 第30-31页 |
| 2.1.8 菌株的活化与保藏 | 第31页 |
| 2.2 产蛋白酶菌株的筛选 | 第31-32页 |
| 2.3 DNA的提取 | 第32页 |
| 2.4 DNA的纯化和回收 | 第32-33页 |
| 2.5 琼脂糖凝胶电泳 | 第33页 |
| 2.6 转化 | 第33-35页 |
| 2.6.1 感受态细胞的制备 | 第33-34页 |
| 2.6.2 DNA的转化 | 第34-35页 |
| 2.7 菌种鉴定 | 第35-37页 |
| 2.7.1 菌种的形态观察 | 第35页 |
| 2.7.2 分子学鉴定 | 第35-36页 |
| 2.7.3 生理生化性质的鉴定 | 第36-37页 |
| 2.8 最小抑菌浓度(MIC)的测定 | 第37-38页 |
| 2.9 蛋白酶的初步提取 | 第38页 |
| 2.9.1 生长曲线的制备 | 第38页 |
| 2.9.2 发酵液的制备 | 第38页 |
| 2.9.3 蛋白酶的初提取 | 第38页 |
| 2.10 ap02基因在大肠杆菌中的表达 | 第38-41页 |
| 2.10.1 目的片段的扩增 | 第38-39页 |
| 2.10.2 表达重组质粒的构建 | 第39-40页 |
| 2.10.3 目的蛋白的诱导表达 | 第40-41页 |
| 2.10.4 目的蛋白的纯化 | 第41页 |
| 2.11 SDS-PAGE电泳分析 | 第41-42页 |
| 2.12 ap02基因对蛋白酶产生菌的影响 | 第42-44页 |
| 2.12.1 载体的选择 | 第42-43页 |
| 2.12.2 表达载体的构建与验证 | 第43-44页 |
| 2.12.3 基因工程菌株的酶活力检测 | 第44页 |
| 2.13 蛋白浓度测定 | 第44-45页 |
| 2.14 酶学性质的测定 | 第45-48页 |
| 2.14.1 原理 | 第45页 |
| 2.14.2 标准曲线的绘制 | 第45-46页 |
| 2.14.3 蛋白酶酶活力的测定 | 第46页 |
| 2.14.4 最适温度的测定 | 第46-47页 |
| 2.14.5 最适pH的测定 | 第47页 |
| 2.14.6 热稳定性的测定 | 第47页 |
| 2.14.7 pH稳定性的测定 | 第47页 |
| 2.14.8 金属离子对酶活力的影响 | 第47页 |
| 2.14.9 化学试剂对酶活力的影响 | 第47-48页 |
| 第三章 蛋白酶活性菌株的鉴定 | 第48-55页 |
| 3.1 引言 | 第48页 |
| 3.2 蛋白酶产生菌的筛选 | 第48-50页 |
| 3.3 形态观察与鉴定 | 第50-51页 |
| 3.4 细菌16S rDNA基因鉴定 | 第51-53页 |
| 3.5 生理生化鉴定 | 第53页 |
| 3.6 最小抑菌浓度的测定 | 第53-54页 |
| 3.7 本章小结 | 第54-55页 |
| 第四章 Pseudomonas aeruginosa sp.DES-3产酶特性及初步提取 | 第55-63页 |
| 4.1 引言 | 第55页 |
| 4.2 生长曲线和pH变化 | 第55-56页 |
| 4.3 硫酸铵分级沉淀 | 第56-57页 |
| 4.4 最适温度的测定 | 第57页 |
| 4.5 最适pH的测定 | 第57-58页 |
| 4.6 温度耐受性 | 第58-59页 |
| 4.7 pH稳定性 | 第59页 |
| 4.8 金属离子对酶活的影响 | 第59-60页 |
| 4.9 化学试剂对酶活的影响 | 第60-61页 |
| 4.10 蛋白酶粗品的制备 | 第61页 |
| 4.11 底物谱分析 | 第61-62页 |
| 4.12 本章小结 | 第62-63页 |
| 第五章 ap02基因的生物信息学分析及在大肠杆菌中的表达 | 第63-78页 |
| 5.1 引言 | 第63页 |
| 5.2 阳性克隆pGXAA2011的表型 | 第63-64页 |
| 5.3 ap02基因的生物信息学分析 | 第64-70页 |
| 5.3.1 pGXAA2011序列结果分析 | 第64-65页 |
| 5.3.2 多重序列比对 | 第65-66页 |
| 5.3.3 进化树的构建 | 第66页 |
| 5.3.4 AP02蛋白信号肽的预测 | 第66-67页 |
| 5.3.5 AP02蛋白的跨膜结构分析 | 第67-68页 |
| 5.3.6 AP02蛋白的亲疏水性分析 | 第68页 |
| 5.3.7 AP02的功能结构域预测 | 第68-69页 |
| 5.3.8 AP02蛋白二级结构预测 | 第69-70页 |
| 5.4 ap02基因的表达重组质粒构建 | 第70-72页 |
| 5.4.1 PCR扩增ap02基因 | 第70页 |
| 5.4.2 目的基因与表达载体的连接与转化 | 第70-71页 |
| 5.4.3 重组质粒的酶切验证 | 第71-72页 |
| 5.5 ap02基因在大肠杆菌中的表达 | 第72-73页 |
| 5.6 重组蛋白AP02的酶学性质鉴定 | 第73-76页 |
| 5.6.1 最适温度的测定 | 第73页 |
| 5.6.2 最适pH的测定 | 第73-74页 |
| 5.6.3 温度耐受性 | 第74-75页 |
| 5.6.4 pH稳定性 | 第75页 |
| 5.6.5 金属离子对酶活的影响 | 第75-76页 |
| 5.6.6 化学试剂对酶活的影响 | 第76页 |
| 5.7 本章小结 | 第76-78页 |
| 第六章 基因ap02对Pseudomonas aeruginosa sp.DES-3产酶影响的探究 | 第78-83页 |
| 6.1 引言 | 第78页 |
| 6.2 ap02基因的表达重组质粒构建 | 第78-81页 |
| 6.2.1 广宿主表达载体的双酶切 | 第78-79页 |
| 6.2.2 目的基因与表达载体的连接与转化 | 第79-80页 |
| 6.2.3 重组质粒的酶切验证 | 第80-81页 |
| 6.3 重组菌株的酶活力检测 | 第81-82页 |
| 6.4 小结 | 第82-83页 |
| 第七章 总结与讨论 | 第83-88页 |
| 7.1 产蛋白酶菌株的筛选 | 第83-84页 |
| 7.2 菌株DES-3产蛋白酶的酶学性质研究 | 第84页 |
| 7.3 底物谱研究 | 第84-85页 |
| 7.4 基因ap02的生物信息学分析 | 第85页 |
| 7.5 AP02蛋白的表达纯化 | 第85-86页 |
| 7.6 基因ap02对菌株DES-3的产酶影响 | 第86-87页 |
| 7.7 展望 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-94页 |
| 附录 | 第94-96页 |
| 致谢 | 第96-98页 |
| 硕士阶段发表论文情况 | 第98页 |
