| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 缩略词表 | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-19页 |
| 1.1 mTOR信号通路 | 第13-14页 |
| 1.1.1 mTOR的结构 | 第13页 |
| 1.1.2 mTOR信号通路的组成及其功能 | 第13-14页 |
| 1.2 p70S6K (S6K1)及其功能 | 第14-16页 |
| 1.2.1 p70S6K1的结构 | 第14页 |
| 1.2.2 p70S6K1的活化 | 第14-15页 |
| 1.2.3 p70S6K1功能 | 第15-16页 |
| 1.3 RPS5研究概况 | 第16-17页 |
| 1.3.1 核糖体蛋白基因与核糖体蛋白 | 第16页 |
| 1.3.2 核糖体蛋白亚单位的不同作用 | 第16-17页 |
| 1.4 酵母双杂交技术 | 第17-19页 |
| 1.4.1 酵母双杂交原理 | 第17页 |
| 1.4.2 酵母双杂交技术的新发展 | 第17-19页 |
| 第二章 酵母双杂交筛选p70S6K相互作用蛋白及RPS5功能初步分析 | 第19-54页 |
| 引言 | 第19-20页 |
| 2.1 材料 | 第20-21页 |
| 2.1.1 绒山羊胎儿成纤维细胞cDNA文库 | 第20页 |
| 2.1.2 使用的酵母菌株和质粒 | 第20页 |
| 2.1.3 使用的主要试剂和仪器设备 | 第20页 |
| 2.1.4 实验主要溶液配置 | 第20-21页 |
| 2.1.5 实验细胞系 | 第21页 |
| 2.2 方法 | 第21-33页 |
| 2.2.1 利用pGBKT7-S6K1酵母双杂交筛选文库实验 | 第21-22页 |
| 2.2.1.1 Y2H和Y187菌株的交配实验 | 第21-22页 |
| 2.2.1.2 使用缺陷培养基四轮筛选 | 第22页 |
| 2.2.1.3 阳性克隆的鉴定 | 第22页 |
| 2.2.2 诱饵质粒pGBKT7-S6K1和筛选出的文库质粒一对一酵母转化杂交筛选验证实验 | 第22-23页 |
| 2.2.2.1 Y2H酵母菌株制备感受态细胞 | 第22-23页 |
| 2.2.2.2 重组质粒转化含有pGBKT7-S6K1质粒的Y2H菌株 | 第23页 |
| 2.2.2.3 使用缺陷培养基进行四轮筛选 | 第23页 |
| 2.2.3 绒山羊胎儿成纤维细胞培养 | 第23-24页 |
| 2.2.4 细胞蛋白质提取 | 第24页 |
| 2.2.5 免疫共沉淀 | 第24页 |
| 2.2.6 Western Blot分析 | 第24-25页 |
| 2.2.7 RPS5基因克隆及序列特征分析 | 第25-28页 |
| 2.2.8 过表达RPS5基因对细胞增殖及细胞周期的影响 | 第28-31页 |
| 2.2.8.1 RPS5基因过表达载体构建并转染细胞 | 第28页 |
| 2.2.8.2 表达载体pIRES2-EGFP-RPS5转染绒山羊胎儿成纤维细胞 | 第28-30页 |
| 2.2.8.3 western blot检测RPS5过表达 | 第30页 |
| 2.2.8.4 MTT检测过表达RPS5基因对细胞增殖的影响 | 第30页 |
| 2.2.8.5 过表达RPS5基因对细胞周期的影响 | 第30-31页 |
| 2.2.8.6 过表达RPS5基因对EGFP表达的影响 | 第31页 |
| 2.2.9 RPS5基因转录后沉默对细胞增殖及细胞周期的影响 | 第31-33页 |
| 2.2.9.1 靶向RPS5基因shRNA表达载体构建并转染细胞 | 第31页 |
| 2.2.9.2 qPCR和western blot检测干扰效率 | 第31-33页 |
| 2.2.9.3 MTT检测RPS5基因沉默对细胞增殖的影响 | 第33页 |
| 2.2.9.4 RPS5基因转录后沉默对细胞周期的影响 | 第33页 |
| 2.3 结果 | 第33-53页 |
| 2.3.1 利用pGBKT7-S6K1筛选文库的酵母双杂交实验获得新的靶蛋白 | 第33-36页 |
| 2.3.1.1 含有不同质粒的两种酵母菌株交配成功 | 第33页 |
| 2.3.1.2 第一轮筛选 | 第33-34页 |
| 2.3.1.3 第二轮筛选 | 第34-35页 |
| 2.3.1.4 第三轮筛选 | 第35页 |
| 2.3.1.5 第四轮筛选 | 第35-36页 |
| 2.3.1.6 酵母菌扩增培养 | 第36页 |
| 2.3.2 筛选出的文库质粒鉴定 | 第36页 |
| 2.3.3 一对一转化酵母回复性验证 | 第36-37页 |
| 2.3.4 阳性克隆基因测序及生物信息学分析得到6个靶蛋白编码基因 | 第37-38页 |
| 2.3.5 免疫共沉淀验证p70S6K与RPS5具有相互作用关系 | 第38-41页 |
| 2.3.6 RPS5基因克隆及序列特征分析 | 第41-44页 |
| 2.3.6.1 RPS5基因克隆 | 第41页 |
| 2.3.6.2 绒山羊RPS5基因序列特征及其编码产物的生物信息学分析 | 第41-44页 |
| 2.3.7 过表达RPS5基因促进细胞增殖及细胞周期进程 | 第44-48页 |
| 2.3.7.1 RPS5基因过表达载体构建并转染细胞 | 第44-45页 |
| 2.3.7.2 western blot检测表明RPS5基因过表达 | 第45-46页 |
| 2.3.7.3 过表达RPS5基因促进细胞增殖 | 第46页 |
| 2.3.7.4 过表达RPS5基因促进细胞周期进程 | 第46-48页 |
| 2.3.7.5 过表达RPS5基因增强IRES连接的EGFP表达 | 第48页 |
| 2.3.8 RPS5基因转录后沉默影响细胞增殖及细胞周期进程 | 第48-53页 |
| 2.3.8.1 靶向RPS5基因shRNA表达载体构建并转染细胞 | 第48-49页 |
| 2.3.8.2 qPCR和western blot检测表明靶向siRNA减弱RPS5表达 | 第49-51页 |
| 2.3.8.3 沉默RPS5基因影响细胞增殖 | 第51页 |
| 2.3.8.4 RPS5基因转录后沉默阻滞细胞周期进程 | 第51-53页 |
| 2.4 讨论 | 第53-54页 |
| 结论 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-59页 |
| 附录 | 第59-62页 |
| 致谢 | 第62-63页 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 | 第63页 |
