| 摘要 | 第4-9页 |
| ABSTRACT | 第9-14页 |
| 缩略词(中英文对照表) | 第22-23页 |
| 第一章 文献综述 | 第23-50页 |
| 前言 | 第23页 |
| 1 哺乳动物细胞核移植的研究进展 | 第23-36页 |
| 1.1 哺乳动物早期核移植研究回顾 | 第23-24页 |
| 1.2 哺乳动物体细胞核移植研究进展 | 第24-25页 |
| 1.3 哺乳动物体细胞核移植技术程序的研究概况 | 第25-36页 |
| 1.3.1 受体卵母细胞 | 第25-28页 |
| 1.3.2 猪卵母细胞去核 | 第28-29页 |
| 1.3.3 注核 | 第29页 |
| 1.3.4 供体细胞的准备 | 第29-34页 |
| 1.3.5 重构胚胎的激活条件的影响 | 第34-35页 |
| 1.3.6 胚胎培养 | 第35页 |
| 1.3.7 胚胎移植 | 第35-36页 |
| 2 转基因克隆猪的研究进展 | 第36-43页 |
| 2.1 转基因克隆猪的制作方法 | 第37-40页 |
| 2.1.1 原核注射法生产转基因动物 | 第38页 |
| 2.1.2 精子介导法 | 第38-39页 |
| 2.1.3 慢病毒法生产转基因动物 | 第39页 |
| 2.1.4 体细胞核移植法生产转基因猪 | 第39-40页 |
| 2.2 转基因克隆猪的应用 | 第40-41页 |
| 2.2.1 猪生物医学的应用 | 第40-41页 |
| 2.2.2 转基因动物在农业上的应用 | 第41页 |
| 2.3 核移植重编程的研究进展 | 第41-42页 |
| 2.4 转基因克隆猪的研究展望 | 第42-43页 |
| 3 Glial Fibrillary Acidic Protein(GFAP)的研究进展 | 第43-48页 |
| 3.1 GFAP作用和功能 | 第44-45页 |
| 3.2 GFAP启动子的研究 | 第45-47页 |
| 3.3 GFAP在疾病中的应用研究 | 第47-48页 |
| 4 研究的目的和意义 | 第48-50页 |
| 第二章 巴马小型猪体细胞的分离培养 | 第50-61页 |
| 1 材料与方法 | 第51-53页 |
| 1.1 主要药品及相关培养液的配制 | 第51页 |
| 1.2 主要仪器设备 | 第51-52页 |
| 1.3 巴马小型猪原代体细胞的分离培养 | 第52页 |
| 1.4 细胞传代培养 | 第52页 |
| 1.5 冷冻保存及复苏 | 第52-53页 |
| 1.6 细胞类型的鉴定 | 第53页 |
| 2 结果分析 | 第53-58页 |
| 2.1 巴马小型猪原代细胞的分离和培养 | 第53-57页 |
| 2.1.1 巴马小型猪耳部成纤维细胞的分离和培养 | 第53-54页 |
| 2.1.2 新生巴马小型猪肾脏成纤维细胞的分离培养 | 第54-55页 |
| 2.1.3 巴马小型猪睾丸成纤维细胞的分离培养 | 第55-56页 |
| 2.1.4 复苏后的细胞正常生长 | 第56-57页 |
| 2.2 细胞类型鉴定 | 第57-58页 |
| 3 讨论 | 第58-59页 |
| 3.1 原代细胞的分离培养 | 第58-59页 |
| 3.2 细胞的传代及细胞类型的鉴定 | 第59页 |
| 4 小结 | 第59-61页 |
| 第三章 转基因细胞系的建立及相关生物学特性的研究 | 第61-84页 |
| 1 材料与方法 | 第61-69页 |
| 1.1 主要药品及液体配制 | 第61-63页 |
| 1.2 各种细胞对博莱霉素的敏感性实验 | 第63页 |
| 1.3 质粒的扩增,提取,鉴定 | 第63-64页 |
| 1.3.1 质粒的扩增 | 第63-64页 |
| 1.3.2 质粒的提取 | 第64页 |
| 1.3.3 质粒的鉴定 | 第64页 |
| 1.4 细胞转染 | 第64-65页 |
| 1.5 转基因体细胞的鉴定 | 第65-66页 |
| 1.6 转基因细胞的生物学特性的研究 | 第66-69页 |
| 1.6.1 转基因细胞活率的统计 | 第66页 |
| 1.6.2 转基因细胞生长特性的研究 | 第66页 |
| 1.6.3 转基因细胞的核型分析 | 第66-67页 |
| 1.6.4 转基因细胞系支原体的检测 | 第67页 |
| 1.6.5 转基因细胞系微生物的检测 | 第67-68页 |
| 1.6.6 转基因细胞系同工酶的检测 | 第68-69页 |
| 2 实验结果 | 第69-81页 |
| 2.1 各种细胞对博莱霉素敏感性实验 | 第69-70页 |
| 2.2 质粒的扩增鉴定 | 第70-71页 |
| 2.3 细胞转染及筛选结果 | 第71-72页 |
| 2.4 转基因克隆斑的鉴定 | 第72页 |
| 2.5 转基因细胞的生物学特性的研究 | 第72-76页 |
| 2.5.1 转基因细胞的活率检测 | 第72-73页 |
| 2.5.2 不同组织来源的转基因细胞系生长动力学研究结果 | 第73-74页 |
| 2.5.3 不同代次细胞的核型分析 | 第74-76页 |
| 2.6 转基因细胞微生物的检测 | 第76-80页 |
| 2.6.1 转基因细胞支原体的检测 | 第76页 |
| 2.6.2 PCR检测各转基因细胞系支原体污染 | 第76-77页 |
| 2.6.3 细菌、真菌的检测结果 | 第77-80页 |
| 2.6.4 各转基因细胞系病毒的检测结果 | 第80页 |
| 2.7 同工酶的检测 | 第80-81页 |
| 3 讨论 | 第81-83页 |
| 4 小结 | 第83-84页 |
| 第四章 转基因克隆胚胎融合激活条件的优化 | 第84-95页 |
| 1 材料与方法 | 第85-90页 |
| 1.1 材料 | 第85-86页 |
| 1.2 巴马小型猪肾脏成纤维细胞的分离培养 | 第86页 |
| 1.3 肾脏成纤维细胞的转染 | 第86页 |
| 1.4 卵母细胞采集和体外成熟培养 | 第86-87页 |
| 1.5 去核和注核 | 第87-88页 |
| 1.6 重构胚胎的激活 | 第88页 |
| 1.7 重构胚胎的体外培养 | 第88-89页 |
| 1.8 囊胚细胞数的统计 | 第89页 |
| 1.9 实验设计 | 第89-90页 |
| 1.10 统计分析 | 第90页 |
| 2 结果分析 | 第90-93页 |
| 2.1 不同电场强度对转基因克隆胚胎发育潜能的影响 | 第90-91页 |
| 2.2 脉冲时间对转基因克隆胚胎发育的影响 | 第91-92页 |
| 2.3 脉冲次数对转基因克隆胚胎发育的影响 | 第92页 |
| 2.4 相同电激活参数下转基因与非转基因克隆胚胎发育潜能的比较 | 第92-93页 |
| 3 讨论 | 第93-94页 |
| 4 小结 | 第94-95页 |
| 第五章 转基因供体细胞对克隆胚胎发育潜能的影响 | 第95-108页 |
| 1 材料与方法 | 第96-99页 |
| 1.1 主要试剂 | 第96页 |
| 1.2 主要仪器设备 | 第96页 |
| 1.3 细胞周期的检测 | 第96-97页 |
| 1.4 细胞凋亡的检测 | 第97页 |
| 1.5 凋亡抗凋亡基因定量表达分析 | 第97-98页 |
| 1.6 实验设计 | 第98-99页 |
| 2 结果分析 | 第99-105页 |
| 2.1 不同的细胞周期同期化方法对转基因巴马小型猪肾脏成纤维细胞同期化效果的影响 | 第99-100页 |
| 2.2 不同的细胞周期同期化方法对巴马小型猪转基因肾脏成纤维细胞凋亡的影响 | 第100-101页 |
| 2.3 三种同期化方法对转基因细胞促凋亡基因BAX和抗凋亡基因BCL-2表达量的影响 | 第101-102页 |
| 2.4 三种同期化处理方法对转基因克隆胚胎发育的影响 | 第102-103页 |
| 2.5 不同组织来源的转基因供体细胞对转基因克隆胚胎发育的影响 | 第103-104页 |
| 2.6 不同代次的转基因肾脏成纤维细胞作为供体核对转基因克隆胚胎发育的影响 | 第104-105页 |
| 3 讨论 | 第105-107页 |
| 4 小结 | 第107-108页 |
| 第六章 组蛋白去乙酰化酶抑制剂oxamflatin对转基因克隆 | 第108-125页 |
| 1 材料与方法 | 第109-112页 |
| 1.1 药品试剂 | 第109页 |
| 1.2 仪器设备 | 第109页 |
| 1.3 核移植胚胎的生产 | 第109页 |
| 1.4 猪卵母细胞体外受精的准备 | 第109-110页 |
| 1.4.1 受精卵母细胞的准备 | 第109-110页 |
| 1.4.2 体外受精 | 第110页 |
| 1.5 免疫组化染色 | 第110页 |
| 1.6 实时定量PCR | 第110-111页 |
| 1.7 实验设计 | 第111-112页 |
| 1.8 统计分析 | 第112页 |
| 2 结果分析 | 第112-122页 |
| 2.1 不同浓度的Oxamflatin处理转基因克隆胚胎对其发育潜能的影响 | 第112-114页 |
| 2.2 oxamflatin的处理时间对转基因克隆胚胎发育的影响 | 第114页 |
| 2.3 oxamflatin对供体细胞周期和凋亡率以及单独处理胚胎和联合处理胚胎,对胚胎发育潜能的影响 | 第114-117页 |
| 2.3.1 不同浓度的oxamflation对转基因细胞周期的影响 | 第114-115页 |
| 2.3.2 不同浓度的oxamflatin对转基因肾脏成纤维细胞凋亡的影响 | 第115-116页 |
| 2.3.3 oxamflatin单独处理供体细胞,处理供体细胞和克隆胚胎,对转基因克隆胚胎发育及表观遗传的影响 | 第116-117页 |
| 2.4 oxamflatin不同浓度和不同作用时间对转基因克隆胚胎囊胚内细胞数的影响 | 第117-119页 |
| 2.4.1 不同浓度的oxamflatin对转基因克隆胚胎囊胚内细胞数的影响 | 第117-118页 |
| 2.4.2 不同的处理时间对囊胚内细胞数的影响 | 第118-119页 |
| 2.5 oxamflatin对猪转基因克隆胚胎组蛋白乙酰化水平的影响 | 第119-122页 |
| 2.6 oxamflatin对转基因克隆胚胎发育相关基因表达的影响 | 第122页 |
| 3 讨论 | 第122-124页 |
| 4 小结 | 第124-125页 |
| 第七章 胚胎移植及转基因克隆猪的鉴定 | 第125-136页 |
| 1 实验材料和方法 | 第125-130页 |
| 1.1 试验试剂和相关液体的配制 | 第125-127页 |
| 1.2 实验器材 | 第127页 |
| 1.3 试验方法 | 第127-129页 |
| 1.3.1 卵母细胞成熟培养 | 第127页 |
| 1.3.2 供体核的准备 | 第127页 |
| 1.3.3 重构胚胎的构建及培养 | 第127页 |
| 1.3.4 胚胎移植 | 第127-129页 |
| 1.4 克隆猪PCR鉴定 | 第129页 |
| 1.5 激光共聚焦荧光显微镜检测克隆猪红色荧光蛋白的表达 | 第129页 |
| 1.5.1 冰冻切片的制备 | 第129页 |
| 1.5.2 激光共聚焦荧光显微镜检测克隆猪红色荧光蛋白的表达 | 第129页 |
| 1.6 Western Blotting检测克隆猪组织中hGFAP-DsRed基因的表达 | 第129-130页 |
| 1.6.1 克隆猪各组织中蛋白样的提取 | 第129页 |
| 1.6.2 蛋白质样电泳 | 第129页 |
| 1.6.3 转膜 | 第129页 |
| 1.6.4 洗膜 | 第129-130页 |
| 1.6.5 封闭 | 第130页 |
| 1.6.6 一抗和二抗孵育 | 第130页 |
| 1.7 实验设计 | 第130页 |
| 2 实验结果 | 第130-134页 |
| 2.1 转基因克隆胚胎体内的发育情况 | 第130-131页 |
| 2.2 转基因克隆猪的鉴定 | 第131-134页 |
| 2.2.1 PCR鉴定 | 第131-132页 |
| 2.2.2 Western Blotting检测hGFAP-DsRed蛋白的表达 | 第132页 |
| 2.2.3 克隆猪病理鉴定 | 第132-134页 |
| 4 讨论 | 第134-135页 |
| 5 小结 | 第135-136页 |
| 总结论 | 第136-137页 |
| 参考文献 | 第137-151页 |
| 致谢 | 第151-153页 |
| 攻读学位期间发表文章情况 | 第153页 |
