| 目录 | 第4-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 符号说明 | 第10-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-20页 |
| 1.1 白僵菌简介 | 第12页 |
| 1.2 白僵菌的致病机理 | 第12-13页 |
| 1.3 PRI蛋白酶 | 第13-15页 |
| 1.4 根瘤农杆菌(AGROBACTERIUM TUMEFACIENS)介导的真菌转化体系 | 第15-17页 |
| 1.4.1 遗传转化筛选标记 | 第15页 |
| 1.4.2 根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的真菌转化体系 | 第15-16页 |
| 1.4.3 元转化体系 | 第16-17页 |
| 1.5 真菌杀虫剂的安全性问题 | 第17页 |
| 1.6 昆虫病原真菌基因工程研究进展 | 第17-18页 |
| 1.7 实验室前期工作 | 第18页 |
| 1.8 本文的研究内容及意义 | 第18-20页 |
| 第二章 材料与方法 | 第20-29页 |
| 2.1 材料 | 第20-22页 |
| 2.1.1 菌种与质粒 | 第20页 |
| 2.1.2 培养基 | 第20-21页 |
| 2.1.3 主要试剂及溶液 | 第21-22页 |
| 2.2 方法 | 第22-29页 |
| 2.2.1 菌体的培养条件 | 第22页 |
| 2.2.2 引物设计 | 第22页 |
| 2.2.3 PCR反应 | 第22-23页 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳 | 第23页 |
| 2.2.5 限制性核酸内切酶酶切 | 第23页 |
| 2.2.6 连接反应 | 第23页 |
| 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第23页 |
| 2.2.8 大肠杆菌中质粒的提取 | 第23-24页 |
| 2.2.9 DNA序列测定 | 第24页 |
| 2.2.10 布氏白僵菌Pr1蛋白酶的诱导及活性测定 | 第24-25页 |
| 2.2.11 布氏白僵菌Pr1蛋白酶的诱导及活性测定 | 第25页 |
| 2.2.12 布氏白僵菌DNA的提取 | 第25页 |
| 2.2.13 布氏白僵菌孢子培养及处理 | 第25页 |
| 2.2.14 根癌农杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第25-26页 |
| 2.2.15 根癌农杆菌中质粒的提取 | 第26页 |
| 2.2.16 大肠杆菌破碎及包涵体处理 | 第26-27页 |
| 2.2.17 利用镍柱法分离提纯His-tag标记酶 | 第27页 |
| 2.2.18 蛋白复性 | 第27页 |
| 2.2.19 蛋白质电泳技术 | 第27-28页 |
| 2.2.20 根瘤农杆菌介导的布氏白僵菌转化 | 第28-29页 |
| 2.2.20.1 布氏白僵菌孢子培养及处理。 | 第28页 |
| 2.2.20.2 根瘤农杆菌的培养及处理 | 第28页 |
| 2.2.20.3 根瘤农杆菌介导布氏白僵菌转化 | 第28-29页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第29-56页 |
| 3.1 布氏白僵菌PR1蛋白酶在大肠杆菌中的表达 | 第29-34页 |
| 3.1.1 构建质粒pBV220-Pr1cDNA ORF(6XHis) | 第29页 |
| 3.1.2 重组子的筛选和酶切鉴定 | 第29-31页 |
| 3.1.3 Pr1蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第31-32页 |
| 3.1.4 重组Pr1蛋白酶包涵体纯化 | 第32页 |
| 3.1.5 重组Pr1蛋白酶的纯化 | 第32页 |
| 3.1.6 变性Pr1蛋白酶的重折叠复性 | 第32-33页 |
| 3.1.7 复性Pr1蛋白酶的酶活测定 | 第33页 |
| 3.1.8 小结 | 第33-34页 |
| 3.2 根瘤农杆菌介导布氏白僵菌遗传转化体系的建立 | 第34-46页 |
| 3.2.1 布氏白僵菌遗传转化筛选标记的确定 | 第34页 |
| 3.2.2 丝状真菌组成型元件表达骨架的构建 | 第34-39页 |
| 3.2.2.1 质粒pUC19-TtrpC的构建 | 第35-36页 |
| 3.2.2.2 质粒pBPT19的构建 | 第36-39页 |
| 3.2.3 草丁磷除草剂抗性基因丝状真菌表达元件的构建 | 第39-41页 |
| 3.2.4 含组成型bar基因表达元件的根瘤农杆菌Ti质粒的构建 | 第41-42页 |
| 3.2.5 重组质粒pROKⅡ-bar导入根瘤农杆菌LBA4404 | 第42-44页 |
| 3.2.6 根瘤农杆菌介导布氏白僵菌遗传转化体系的建立 | 第44-46页 |
| 3.2.7 小结 | 第46页 |
| 3.3 构建布氏白僵菌类枯草杆菌蛋白酶PR1组成型表达工程菌株 | 第46-56页 |
| 3.3.1 类枯草杆菌蛋白酶Pr1基因丝状真菌表达元件的构建 | 第47-49页 |
| 3.3.2 含组成型Pr1基因表达元件和bar基因表达元件的根瘤农杆菌Ti质粒的构建 | 第49-53页 |
| 3.3.3 重组质粒pROKⅡ-bar-Pr1导入根瘤农杆菌LBA4404 | 第53页 |
| 3.3.4 组成型超表达Pr1蛋白酶布氏白僵菌工程菌株的构建 | 第53-54页 |
| 3.3.5 布氏白僵菌工程菌株Pr1蛋白酶酶活测定 | 第54-56页 |
| 总结 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第62页 |
