| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第11-22页 |
| 1.1 葡萄糖氧化酶概述 | 第11-14页 |
| 1.1.1 葡萄糖氧化酶反应机制 | 第11页 |
| 1.1.2 葡萄糖氧化酶的酶学性质 | 第11-12页 |
| 1.1.3 葡萄糖氧化酶的应用 | 第12-14页 |
| 1.2 葡萄糖氧化酶的生产 | 第14-16页 |
| 1.2.1 葡萄糖氧化酶的来源 | 第14页 |
| 1.2.2 产葡萄糖氧化酶野生菌的研究进展 | 第14-15页 |
| 1.2.3 葡萄糖氧化酶基因异源表达的研究进展 | 第15-16页 |
| 1.3 葡萄糖氧化酶的结构及分子改造研究 | 第16-17页 |
| 1.3.1 葡萄糖氧化酶的催化活性中心 | 第16-17页 |
| 1.3.2 葡萄糖氧化酶的分子改造 | 第17页 |
| 1.4 酵母表达系统 | 第17-20页 |
| 1.4.1 酵母真核表达系统中蛋白折叠及分泌 | 第18-19页 |
| 1.4.2 酵母真核表达系统中蛋白折叠压力 | 第19-20页 |
| 1.4.3 改造酵母真核表达系统的研究进展 | 第20页 |
| 1.5 论文主要研究内容 | 第20-22页 |
| 1.5.1 立题依据及研究意义 | 第20-21页 |
| 1.5.2 主要研究内容 | 第21-22页 |
| 第二章 产葡萄糖氧化酶野生菌的筛选鉴定及 GOD 基因在 P. pastoris 中的异源表达 | 第22-40页 |
| 2.1 前言 | 第22页 |
| 2.2 材料与方法 | 第22-28页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第22页 |
| 2.2.2 试剂及仪器 | 第22-23页 |
| 2.2.3 培养基 | 第23页 |
| 2.2.4 实验方法 | 第23-25页 |
| 2.2.5 分析方法 | 第25页 |
| 2.2.6 筛选菌株的遗传学鉴定 | 第25页 |
| 2.2.7 重组菌的构建方法 | 第25-27页 |
| 2.2.8 重组葡萄糖氧化酶 GOD 的分离纯化 | 第27页 |
| 2.2.9 重组葡萄糖氧化酶 GOD 的酶学性质研究 | 第27-28页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第28-38页 |
| 2.3.1 产葡萄糖氧化酶菌株的平板筛选 | 第28-29页 |
| 2.3.2 菌株葡萄糖氧化酶活性的测定 | 第29-30页 |
| 2.3.3 菌株的鉴定 | 第30-31页 |
| 2.3.4 葡萄糖氧化酶基因 GOD 的克隆与分析 | 第31-34页 |
| 2.3.5 重组 GOD 的异源表达 | 第34-35页 |
| 2.3.6 重组 GOD 的分离纯化 | 第35-36页 |
| 2.3.7 重组 GOD 的酶学性质研究 | 第36-38页 |
| 2.4 本章小结 | 第38-40页 |
| 第三章 改造 GOD 辅酶 FAD 与底物结合位点提高催化活性 | 第40-53页 |
| 3.1 前言 | 第40页 |
| 3.2 材料与方法 | 第40-43页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第40页 |
| 3.2.2 试剂及仪器 | 第40页 |
| 3.2.3 培养基 | 第40-41页 |
| 3.2.4 分析方法 | 第41页 |
| 3.2.5 重组菌的构建方法 | 第41-43页 |
| 3.2.6 重组葡萄糖氧化酶 GOD 的分离纯化 | 第43页 |
| 3.2.7 重组葡萄糖氧化酶 GOD 的酶学性质研究 | 第43页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第43-51页 |
| 3.3.1 葡萄糖氧化酶蛋白结构比对与分析 | 第43-44页 |
| 3.3.2 葡萄糖氧化酶分子改造位点分析 | 第44-45页 |
| 3.3.3 突变型 GOD 构建表达及分离纯化 | 第45页 |
| 3.3.4 单点突变改造辅酶 FAD 与底物结合位点对酶动力学参数的影响 | 第45-46页 |
| 3.3.5 单点突变改造对葡萄糖氧化酶 pH 稳定性的影响 | 第46-47页 |
| 3.3.6 单点突变改造对葡萄糖氧化酶反应温度及稳定性的影响 | 第47页 |
| 3.3.7 复合突变对 GOD 突变体酶动力学参数的影响 | 第47-48页 |
| 3.3.8 复合突变对 GOD 突变体酶学性质的影响 | 第48-49页 |
| 3.3.9 野生型重组 rGOD 及突变体蛋白二级结构的分析 | 第49-50页 |
| 3.3.10 突变体蛋白结构模拟分析 | 第50-51页 |
| 3.4 本章小结 | 第51-53页 |
| 第四章 过氧化氢酶结构域融合提高 GOD 的催化效率 | 第53-67页 |
| 4.1 前言 | 第53页 |
| 4.2 材料与方法 | 第53-56页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第53页 |
| 4.2.2 试剂及仪器 | 第53页 |
| 4.2.3 培养基 | 第53页 |
| 4.2.4 分析方法 | 第53-54页 |
| 4.2.5 重组菌的构建方法 | 第54-55页 |
| 4.2.6 重组葡萄糖氧化酶 GOD 的分离纯化 | 第55页 |
| 4.2.7 重组葡萄糖氧化酶 GOD 的酶学性质研究 | 第55-56页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第56-65页 |
| 4.3.1 黑曲霉来源过氧化氢酶蛋白序列比对及分析 | 第56-57页 |
| 4.3.2 黑曲霉来源过氧化氢酶结构模拟 | 第57-58页 |
| 4.3.3 融合突变体的构建及分离纯化 | 第58-59页 |
| 4.3.4 C 端与 N 端融合 CAT 结构域对酶动力学参数的影响 | 第59-60页 |
| 4.3.5 C 端与 N 端融合 CAT 结构域对酶耐氧化性的影响 | 第60-61页 |
| 4.3.6 融合突变对酶 pH 和温度稳定性的影响 | 第61-62页 |
| 4.3.7 融合突变体蛋白二级结构的分析 | 第62页 |
| 4.3.8 融合突变体结构模拟分析 | 第62-65页 |
| 4.4 本章小结 | 第65-67页 |
| 第五章 共表达 HAC1 基因对重组 P. pastoris 分泌表达 GOD 的影响 | 第67-78页 |
| 5.1 前言 | 第67页 |
| 5.2 材料与方法 | 第67-70页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第67-68页 |
| 5.2.2 试剂及仪器 | 第68页 |
| 5.2.3 培养基及培养方法 | 第68页 |
| 5.2.4 分析方法 | 第68-69页 |
| 5.2.5 重组菌的构建方法 | 第69-70页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第70-76页 |
| 5.3.1 重组 HAC1 共表达基因工程菌的构建 | 第70-71页 |
| 5.3.2 共表达 HAC1 基因对 GOD 表达的影响 | 第71-72页 |
| 5.3.3 3 L 发酵罐中不同培养温度对共表达 HAC1 重组菌产 GOD 的影响 | 第72-75页 |
| 5.3.4 UPR 下游靶基因转录水平变化 | 第75-76页 |
| 5.4 本章小结 | 第76-78页 |
| 第六章 改造蛋白分泌通路提高 GOD 在毕赤酵母中的发酵生产 | 第78-97页 |
| 6.1 前言 | 第78页 |
| 6.2 材料与方法 | 第78-84页 |
| 6.2.1 菌株和质粒 | 第78-80页 |
| 6.2.2 试剂及仪器 | 第80-81页 |
| 6.2.3 培养基及培养方法 | 第81页 |
| 6.2.4 分析方法 | 第81-82页 |
| 6.2.5 重组菌的构建方法 | 第82-84页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第84-95页 |
| 6.3.1 P. pastoris 表达系统中提高蛋白分泌的潜在途径模块的分析 | 第84-86页 |
| 6.3.2 P. pastoris 表达系统中蛋白分泌途径模块改造对 GOD 发酵的影响 | 第86-89页 |
| 6.3.3 蛋白分泌途径模块优化对外源表达 GOD 的影响 | 第89-92页 |
| 6.3.4 模块化改造对毕赤酵母胞内 ROS 水平的影响 | 第92-93页 |
| 6.3.5 5M~3发酵罐工艺放大初步研究 | 第93-95页 |
| 6.4 本章小结 | 第95-97页 |
| 主要结论与展望 | 第97-99页 |
| 主要结论 | 第97-98页 |
| 展望 | 第98-99页 |
| 论文创新点 | 第99-100页 |
| 致谢 | 第100-101页 |
| 参考文献 | 第101-111页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第111-112页 |
