| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 目录 | 第7-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-24页 |
| 1.1 角蛋白及角蛋白酶概述 | 第11-19页 |
| 1.1.1 角蛋白简介 | 第11页 |
| 1.1.2 角蛋白酶的分类 | 第11-12页 |
| 1.1.3 角蛋白酶的理化性质 | 第12-15页 |
| 1.1.4 角蛋白酶的结构和底物特异性 | 第15-16页 |
| 1.1.5 角蛋白酶的发酵优化 | 第16页 |
| 1.1.6 角蛋白酶的克隆表达及分子改造 | 第16-18页 |
| 1.1.7 角蛋白酶的主要应用 | 第18-19页 |
| 1.2 提高蛋白质热稳定性的策略 | 第19-22页 |
| 1.2.1 非理性设计 | 第20页 |
| 1.2.2 理性设计 | 第20-22页 |
| 1.3 立项依据和研究意义 | 第22页 |
| 1.4 本论文的主要研究内容 | 第22-24页 |
| 第二章 产角蛋白酶菌株的筛选及角蛋白酶基因的异源表达 | 第24-43页 |
| 2.1 前言 | 第24页 |
| 2.2 材料与方法 | 第24-30页 |
| 2.2.1 质粒、菌株和引物 | 第24-25页 |
| 2.2.2 试剂及仪器 | 第25-26页 |
| 2.2.3 培养基 | 第26-27页 |
| 2.2.4 菌种筛选方法 | 第27页 |
| 2.2.5 DNA 操作方法 | 第27-28页 |
| 2.2.6 培养条件 | 第28-29页 |
| 2.2.7 分析方法 | 第29-30页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第30-41页 |
| 2.3.1 产角蛋白酶菌株的筛选 | 第30页 |
| 2.3.2 菌株的遗传学鉴定 | 第30-32页 |
| 2.3.3 ker 基因的克隆与分析 | 第32-33页 |
| 2.3.4 ker 基因在大肠杆菌中的表达 | 第33-34页 |
| 2.3.5 IPTG 和酵母粉浓度对重组角蛋白酶在大肠杆菌中分泌表达的影响 | 第34-35页 |
| 2.3.6 ker 基因在枯草芽孢杆菌中的表达 | 第35-37页 |
| 2.3.7 碳源和金属离子对重组角蛋白酶在枯草芽孢杆菌中分泌表达的影响 | 第37-38页 |
| 2.3.8 ker 基因在毕赤酵母中的表达 | 第38-39页 |
| 2.3.9 重组 B. subtilis WB600 的分批发酵 | 第39-40页 |
| 2.3.10 重组 P. pastoris GS115 的高密度发酵 | 第40-41页 |
| 2.4 本章小结 | 第41-43页 |
| 第三章 重组角蛋白酶的酶学性质研究与应用效果评价 | 第43-53页 |
| 3.1 前言 | 第43页 |
| 3.2 材料与方法 | 第43-45页 |
| 3.2.1 菌株 | 第43页 |
| 3.2.2 仪器与试剂 | 第43-44页 |
| 3.2.3 培养基及培养条件 | 第44页 |
| 3.2.4 重组酶的分离纯化 | 第44页 |
| 3.2.5 羊毛防毡缩处理 | 第44页 |
| 3.2.6 分析方法 | 第44-45页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第45-51页 |
| 3.3.1 重组角蛋白酶的纯化 | 第45-46页 |
| 3.3.2 重组角蛋白酶的最适反应 pH 和 pH 稳定性 | 第46-47页 |
| 3.3.3 重组角蛋白酶的最适反应温度和温度稳定性 | 第47-48页 |
| 3.3.4 金属离子、螯合剂及不可逆抑制剂对角蛋白酶酶活的影响 | 第48页 |
| 3.3.5 表面活性剂、还原剂，漂白剂对角蛋白酶稳定性的影响 | 第48-49页 |
| 3.3.6 K:C 值的测定 | 第49-50页 |
| 3.3.7 重组角蛋白酶的动力学参数测定 | 第50页 |
| 3.3.8 角蛋白酶对羊毛防毡缩应用效果评估 | 第50-51页 |
| 3.4 本章小结 | 第51-53页 |
| 第四章 计算机辅助分析提高角蛋白酶的热稳定性 | 第53-65页 |
| 4.1 前言 | 第53页 |
| 4.2 材料与方法 | 第53-55页 |
| 4.2.1 菌株 | 第53页 |
| 4.2.2 仪器与试剂 | 第53页 |
| 4.2.3 DNA 操作 | 第53-54页 |
| 4.2.4 培养基及培养条件 | 第54页 |
| 4.2.5 晶体结构模型的构建及结构分析 | 第54页 |
| 4.2.6 不稳定区域的预测 | 第54-55页 |
| 4.2.7 野生型与突变体角蛋白酶的纯化 | 第55页 |
| 4.2.8 分析方法 | 第55页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第55-64页 |
| 4.3.1 角蛋白酶三维结构的模拟 | 第55-56页 |
| 4.3.2 突变位点的预测 | 第56-59页 |
| 4.3.3 突变对角蛋白酶活力的影响 | 第59-60页 |
| 4.3.4 突变对角蛋白酶热稳定性的影响 | 第60-61页 |
| 4.3.5 突变体的结构模拟及分析 | 第61-63页 |
| 4.3.6 突变对角蛋白酶催化活力的影响 | 第63-64页 |
| 4.4 本章小结 | 第64-65页 |
| 第五章 角蛋白酶底物结合区域的分析与改造 | 第65-73页 |
| 5.1 前言 | 第65页 |
| 5.2 材料与方法 | 第65-67页 |
| 5.2.1 菌株 | 第65页 |
| 5.2.2 仪器与试剂 | 第65-66页 |
| 5.2.3 DNA 操作 | 第66页 |
| 5.2.4 培养基及培养条件 | 第66页 |
| 5.2.5 晶体结构模型的构建及结构分析 | 第66页 |
| 5.2.6 野生型与突变体角蛋白酶的纯化 | 第66页 |
| 5.2.7 分析方法 | 第66-67页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第67-71页 |
| 5.3.1 突变体对角蛋白酶底物特异性的影响 | 第67-69页 |
| 5.3.2 突变体对羊毛鳞片降解的氨基酸分析 | 第69-70页 |
| 5.3.3 突变体角蛋白酶的动力学分析 | 第70页 |
| 5.3.4 突变体角蛋白酶的羊毛织物防毡缩效果评估 | 第70-71页 |
| 5.4 本章小结 | 第71-73页 |
| 第六章 角蛋白酶前导肽切割区域的分析与改造 | 第73-89页 |
| 6.1 前言 | 第73-74页 |
| 6.2 材料与方法 | 第74-76页 |
| 6.2.1 菌株 | 第74页 |
| 6.2.2 仪器与试剂 | 第74页 |
| 6.2.3 DNA 操作 | 第74-75页 |
| 6.2.4 培养基及培养条件 | 第75-76页 |
| 6.2.5 晶体结构模型的构建及结构分析 | 第76页 |
| 6.2.6 野生型与突变体角蛋白酶的纯化 | 第76页 |
| 6.2.7 分析方法 | 第76页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第76-87页 |
| 6.3.1 前导肽切割位点 Leu(P1)对成熟酶胞外分泌的影响 | 第76-78页 |
| 6.3.2 前导肽 C 端对成熟酶胞外分泌的影响 | 第78-79页 |
| 6.3.3 成熟酶 N 端对其活力的影响 | 第79-83页 |
| 6.3.4 组合突变体的酶学性质检测 | 第83页 |
| 6.3.5 恒速流加对 B. subtilis 发酵产酶的影响 | 第83-86页 |
| 6.3.6 诱导菌体密度对 B. subtilis 发酵产酶的影响 | 第86-87页 |
| 6.4 本章小结 | 第87-89页 |
| 主要结论与展望 | 第89-92页 |
| 主要结论 | 第89-91页 |
| 展望 | 第91-92页 |
| 论文创新点 | 第92-93页 |
| 致谢 | 第93-95页 |
| 参考文献 | 第95-106页 |
| 附录 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第106页 |
