| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第12-24页 |
| 1.1 黑色素概述 | 第12-15页 |
| 1.1.1 黑色素的性质与合成途径 | 第12-13页 |
| 1.1.2 黑色素的用途 | 第13-14页 |
| 1.1.3 黑色素的生产方法 | 第14页 |
| 1.1.4 黑色素生产菌株 | 第14-15页 |
| 1.2 酪氨酸酶概述 | 第15-20页 |
| 1.2.1 酪氨酸酶的来源及应用 | 第15-16页 |
| 1.2.2 酪氨酸酶的分类 | 第16-17页 |
| 1.2.3 链霉菌酪氨酸酶 | 第17-20页 |
| 1.3 酶热稳定性的提高策略 | 第20-22页 |
| 1.3.1 非理性设计 | 第20页 |
| 1.3.2 理性设计 | 第20-22页 |
| 1.4 本课题研究意义与内容 | 第22-24页 |
| 1.4.1 课题研究意义 | 第22页 |
| 1.4.2 本课题研究内容 | 第22-24页 |
| 第二章 产黑色素菌株的筛选、鉴定及发酵条件研究 | 第24-53页 |
| 2.1 材料与仪器 | 第24-25页 |
| 2.1.1 主要试剂材料 | 第24页 |
| 2.1.2 主要实验仪器 | 第24页 |
| 2.1.3 土样 | 第24页 |
| 2.1.4 培养基 | 第24-25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-33页 |
| 2.2.1 土样采集 | 第25页 |
| 2.2.2 富集培养 | 第25-26页 |
| 2.2.3 纯种分离及筛选方法 | 第26页 |
| 2.2.4 菌株的生理生化及形态学鉴定 | 第26页 |
| 2.2.5 菌株的分子生物学鉴定 | 第26-28页 |
| 2.2.6 黑色素的提取与纯化 | 第28页 |
| 2.2.7 菌株所产黑色素性质 | 第28-30页 |
| 2.2.8 菌株产黑色素摇瓶发酵研究 | 第30-32页 |
| 2.2.9 分析方法 | 第32-33页 |
| 2.3 实验结果 | 第33-51页 |
| 2.3.1 产黑色素菌株的初筛 | 第33页 |
| 2.3.2 产黑色素菌株的复筛及初始发酵培养基的确定 | 第33-34页 |
| 2.3.3 菌株鉴定 | 第34-36页 |
| 2.3.4 菌株SC-1 所产黑色素结构特性 | 第36-38页 |
| 2.3.5 黑色素的理化性质 | 第38-39页 |
| 2.3.6 发酵条件对菌株SC-1 发酵产黑色素的影响 | 第39-42页 |
| 2.3.7 碳源对菌株SC-1 发酵产黑色素的影响 | 第42-43页 |
| 2.3.8 氮源对菌株SC-1 发酵产黑色素的影响 | 第43-44页 |
| 2.3.9 无机盐对菌株SC-1 发酵产黑色素的影响 | 第44-45页 |
| 2.3.10 Plackett-Burman Design | 第45-47页 |
| 2.3.11 最陡爬坡实验 | 第47页 |
| 2.3.12 Response Surface Methodology实验 | 第47-50页 |
| 2.3.13 优化前后黑色素发酵过程曲线 | 第50-51页 |
| 2.4 讨论 | 第51-52页 |
| 2.5 本章小结 | 第52-53页 |
| 第三章 S. kathirae SC-1 产黑色素关键酶酪氨酸酶的分离纯化及酶学性质 | 第53-64页 |
| 3.1 材料与仪器 | 第53-54页 |
| 3.1.1 主要试剂材料与菌株 | 第53页 |
| 3.1.2 主要实验仪器 | 第53页 |
| 3.1.3 培养基 | 第53-54页 |
| 3.2 实验方法 | 第54-56页 |
| 3.2.1 酪氨酸酶活测定 | 第54页 |
| 3.2.2 蛋白质含量测定 | 第54页 |
| 3.2.3 酪氨酸酶的提取及分离纯化 | 第54页 |
| 3.2.4 酪氨酸酶粗酶液的制备 | 第54页 |
| 3.2.5 (NH4)2SO4分级沉淀 | 第54页 |
| 3.2.6 QFF琼脂糖凝胶阴离子交换层析 | 第54-55页 |
| 3.2.7 蛋白质电泳 | 第55页 |
| 3.2.8 变性蛋白酶解 | 第55页 |
| 3.2.9 酪氨酸酶酶学性质研究 | 第55-56页 |
| 3.3 结果 | 第56-62页 |
| 3.3.1 酪氨酸酶的纯化 | 第56-58页 |
| 3.3.2 酪氨酸酶的最适pH及pH稳定性 | 第58-59页 |
| 3.3.3 酪氨酸酶的最适温度及温度稳定性 | 第59-60页 |
| 3.3.4 金属离子对酪氨酸酶活性的影响 | 第60-61页 |
| 3.3.5 氨基酸对酪氨酸酶活性的影响 | 第61页 |
| 3.3.6 酶保护剂对酪氨酸酶活性的影响 | 第61-62页 |
| 3.3.7 酪氨酸酶的酶动力学研究 | 第62页 |
| 3.4 讨论 | 第62-63页 |
| 3.5 本章小结 | 第63-64页 |
| 第四章 酪氨酸酶的克隆、序列分析及功能验证 | 第64-83页 |
| 4.1 材料与仪器 | 第64-66页 |
| 4.1.1 主要试剂材料与菌株 | 第64-65页 |
| 4.1.2 主要实验仪器 | 第65页 |
| 4.1.3 培养基及缓冲液 | 第65-66页 |
| 4.2 实验方法 | 第66-72页 |
| 4.2.1 菌株SC-1 基因组DNA的提取 | 第66页 |
| 4.2.2 引物设计 | 第66页 |
| 4.2.3 TAIL-PCR引物设计及PCR反应 | 第66-68页 |
| 4.2.4 链霉菌原生质体的制备 | 第68-69页 |
| 4.2.5 链霉菌原生质体的转化 | 第69页 |
| 4.2.6 表达载体的构建与转化 | 第69-70页 |
| 4.2.7 启动子的确定 | 第70-72页 |
| 4.2.8 RT-PCR | 第72页 |
| 4.2.9 分析方法 | 第72页 |
| 4.3 结果 | 第72-81页 |
| 4.3.1 melC部分基因片段的获得 | 第72-73页 |
| 4.3.2 TAIL-PCR扩增SC-1 菌株melC上下游基因 | 第73页 |
| 4.3.3 菌株SC-1 的melC基因序列分析 | 第73-76页 |
| 4.3.4 melC在S. lividans中的表达 | 第76-78页 |
| 4.3.5 在S. lividans中启动子鉴定 | 第78-80页 |
| 4.3.6 基因melC在S. kathirae中表达及其黑色素合成的影响 | 第80-81页 |
| 4.4 讨论 | 第81-82页 |
| 4.5 本章小结 | 第82-83页 |
| 第五章 酪氨酸酶在大肠杆菌中的表达与分析 | 第83-96页 |
| 5.1 材料与仪器 | 第83页 |
| 5.1.1 主要试剂材料与菌株 | 第83页 |
| 5.1.2 主要实验仪器 | 第83页 |
| 5.1.3 培养基 | 第83页 |
| 5.2 实验方法 | 第83-86页 |
| 5.2.1 菌株SC-1 基因组DNA的提取 | 第83页 |
| 5.2.2 重组质粒的构建 | 第83-84页 |
| 5.2.3 共表达质粒的构建 | 第84-85页 |
| 5.2.4 重组基因的表达研究 | 第85页 |
| 5.2.5 重组蛋白的分离纯化 | 第85页 |
| 5.2.6 分析方法 | 第85-86页 |
| 5.3 结果 | 第86-95页 |
| 5.3.1 表达载体的构建及基因的表达 | 第86-88页 |
| 5.3.2 重组菌株E. coli BL21/pET-melC1NC2 的构建及酪氨酸酶表达 | 第88-91页 |
| 5.3.3 诱导剂浓度对重组菌产酪氨酸酶的影响 | 第91-92页 |
| 5.3.4 诱导时间对重组菌产酪氨酸酶的影响 | 第92-93页 |
| 5.3.5 重组酪氨酸酶的纯化及酶学性质研究 | 第93-95页 |
| 5.4 讨论 | 第95页 |
| 5.5 本章小结 | 第95-96页 |
| 第六章 酪氨酸酶的分子定向改造 | 第96-110页 |
| 6.1 材料与仪器 | 第96-97页 |
| 6.1.1 主要试剂材料与菌株 | 第96页 |
| 6.1.2 主要实验仪器 | 第96页 |
| 6.1.3 培养基 | 第96-97页 |
| 6.2 实验方法 | 第97-99页 |
| 6.2.1 定点突变方法 | 第97页 |
| 6.2.2 突变位点的选取与引物设计 | 第97页 |
| 6.2.3 PCR扩增 | 第97-98页 |
| 6.2.4 DpnI消化模板质粒 | 第98页 |
| 6.2.5 重组菌株的构建 | 第98页 |
| 6.2.6 组合突变重组菌株的构建 | 第98页 |
| 6.2.7 重组酪氨酸酶酶学性质研究 | 第98-99页 |
| 6.2.8 圆二色谱分析 | 第99页 |
| 6.2.9 链霉菌表达质粒的构建 | 第99页 |
| 6.2.10 链霉菌原生质体的制备 | 第99页 |
| 6.2.11 链霉菌原生质体的转化 | 第99页 |
| 6.2.12 分析方法 | 第99页 |
| 6.3 结果 | 第99-108页 |
| 6.3.1 酪氨酸酶突变位点的选取 | 第99-100页 |
| 6.3.2 酪氨酸酶基因突变菌株的构建及表达分析 | 第100-103页 |
| 6.3.3 组合突变 | 第103-104页 |
| 6.3.4 酪氨酸酶及其突变体的结构分析 | 第104-108页 |
| 6.4 讨论 | 第108页 |
| 6.5 本章小结 | 第108-110页 |
| 主要结论与展望 | 第110-113页 |
| 主要结论 | 第110-111页 |
| 展望 | 第111-112页 |
| 论文的创新点 | 第112-113页 |
| 致谢 | 第113-114页 |
| 参考文献 | 第114-122页 |
| 附录I：作者在攻读博士期间发表的论文及申请的专利 | 第122-123页 |
| 附录II：菌株SC-1 的 16Sr RNA序列 | 第123-124页 |
| 附录III：S. kathirae SC-1 酪氨酸酶操纵子mel C基因序列 | 第124页 |
