| 摘要 | 第1-4页 |
| Summary | 第4-9页 |
| 缩写词英汉对照表 | 第9-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-20页 |
| 1 猪瘟诊断技术研究现状 | 第11-13页 |
| ·病原 | 第11-12页 |
| ·临床症状及病理变化 | 第12页 |
| ·诊断方法 | 第12-13页 |
| ·感染性病毒检测 | 第12-13页 |
| ·病毒抗原检测 | 第13页 |
| ·抗体检测 | 第13页 |
| ·分子生物学检测 | 第13页 |
| 2 猪繁殖与呼吸综合征诊断技术研究现状 | 第13-16页 |
| ·病原 | 第13-14页 |
| ·临床症状及病理变化 | 第14页 |
| ·诊断方法 | 第14-16页 |
| ·病毒分离与鉴定 | 第14页 |
| ·抗原检测 | 第14-15页 |
| ·血清学检测 | 第15-16页 |
| ·分子生物学诊断技术 | 第16页 |
| 3 猪乙型脑炎诊断技术研究现状 | 第16-18页 |
| ·病原 | 第17页 |
| ·临床症状及病理变化 | 第17页 |
| ·诊断方法 | 第17-18页 |
| 4 PCR 诊断技术的发展和应用 | 第18-19页 |
| 5 研究目的和意义 | 第19页 |
| 6 研究内容和方法 | 第19-20页 |
| ·建立多重二温式PCR 检测方法 | 第19页 |
| ·建立One-Step TaqMan~((?))探针多重实时荧光定量RT-PCR 检测方法 | 第19-20页 |
| 第二章 CSFV、PRRSV 和JEV 单项二温式PCR 检测方法的建立 | 第20-30页 |
| 1 材料与方法 | 第20-25页 |
| ·病毒、菌株、细胞和载体 | 第20页 |
| ·主要仪器与试剂 | 第20-21页 |
| ·引物设计与合成 | 第21页 |
| ·病毒核酸的提取及目的DNA 片段的克隆 | 第21-23页 |
| ·病毒基因组RNA 的提取 | 第21-22页 |
| ·病毒基因组DNA 的提取 | 第22页 |
| ·CSFV、PRRSV 和JEV cDNA 模板的制备 | 第22页 |
| ·CSFV、PRRSV 和JEV PCR 扩增反应及电泳成像 | 第22页 |
| ·PCR 产物胶回收纯化 | 第22页 |
| ·胶回收产物连接转化 | 第22页 |
| ·CaCl_2 法制备TOP 10 大肠杆菌感受态细胞 | 第22-23页 |
| ·连接产物转化 | 第23页 |
| ·菌落PCR 筛选阳性克隆及测序验证 | 第23页 |
| ·重组质粒模板标准品的制备 | 第23页 |
| ·重组质粒浓度的测定 | 第23页 |
| ·CSFV、PRRSV 和JEV 单项二温式PCR 反应条件的优化 | 第23-24页 |
| ·退火温度（Tm） | 第23页 |
| ·引物浓度 | 第23-24页 |
| ·dNTPs 浓度 | 第24页 |
| ·MgC1_2 浓度 | 第24页 |
| ·rTaq DNA Polymerase 浓度的优化 | 第24页 |
| ·敏感性试验 | 第24页 |
| ·特异性试验 | 第24-25页 |
| ·临床病料验证 | 第25页 |
| ·与传统三阶温式PCR 检测法比较 | 第25页 |
| 2 结果 | 第25-28页 |
| ·CSFV、PRRSV 和JEV 目的基因片段扩增 | 第25页 |
| ·CSFV、PRRSV 和JEV 单项二温式RT-PCR 反应优化条件 | 第25-28页 |
| ·退火温度（Tm） | 第25-26页 |
| ·dNTPs 浓度 | 第26页 |
| ·MgC1_2 浓度 | 第26-27页 |
| ·rTaq DNA Polymerase 浓度 | 第27页 |
| ·敏感性试验 | 第27页 |
| ·特异性试验 | 第27-28页 |
| ·稳定性试验 | 第28页 |
| ·临床验证 | 第28页 |
| ·与传统PCR 检测法比较 | 第28页 |
| 3 讨论 | 第28-30页 |
| 第三章 CSFV、PRRSV 和JEV 多重二温式PCR 检测方法的建立 | 第30-36页 |
| 1 材料与方法 | 第30-31页 |
| ·多重二温式PCR 反应体系和反应条件优化 | 第30-31页 |
| ·退火温度（Tm） | 第30页 |
| ·引物浓度 | 第30-31页 |
| ·Mg~(2+)浓度 | 第31页 |
| ·dNTPs 浓度 | 第31页 |
| ·rTaq DNA 聚合酶浓度 | 第31页 |
| ·敏感性试验 | 第31页 |
| ·特异性试验 | 第31页 |
| ·稳定性试验 | 第31页 |
| ·临床病料验证 | 第31页 |
| 2 结果 | 第31-34页 |
| ·多重二温式RT-PCR 反应体系和反应条件优化 | 第31-33页 |
| ·CSFV 和PRRSV、PRRSV 和JEV 二重二温式PCR 反应体系和反应条件优化 | 第31-32页 |
| ·CSFV、PRRSV 和JEV 三重二温式RT-PCR 反应体系和反应条件优化 | 第32-33页 |
| ·多重二温式RT-PCR 敏感性试验 | 第33页 |
| ·多重二温式RT-PCR 特异性试验 | 第33页 |
| ·多重二温式RT-PCR 临床病料验证 | 第33-34页 |
| 3 讨论 | 第34-36页 |
| 第四章 CSF、PRRS 及JE 单项实时荧光定量RT-PCR 诊断方法的建立 | 第36-45页 |
| 1 材料与方法 | 第36-39页 |
| ·实时荧光定量RT-PCR 引物和探针的设计 | 第36页 |
| ·实时荧光定量RT-PCR 检测方法的建立 | 第36-38页 |
| ·病毒基因组RNA 的提取 | 第36-37页 |
| ·One-Step RT-PCR 扩增体外转录用目的DNA 片段与克隆 | 第37-38页 |
| ·体外转录RNA 模板标准品的制备 | 第38页 |
| ·一步法实时荧光定量RT-PCR 检测方法的建立 | 第38-39页 |
| ·特异性试验 | 第38页 |
| ·动力学扩增曲线及标准曲线的建立 | 第38页 |
| ·敏感性试验 | 第38-39页 |
| ·重复性和稳定性试验 | 第39页 |
| ·临床疑似病料检测 | 第39页 |
| ·PRRSV 阳性病料检测验证 | 第39页 |
| 2 结果 | 第39-43页 |
| ·CSFV、PRRSV 及JEV 单项RQ-RT-PCR 动力学扩增曲线及标准曲线 | 第39-40页 |
| ·CSFV 敏感性试验 | 第40-41页 |
| ·重复性及稳定性试验 | 第41页 |
| ·特异性试验 | 第41-43页 |
| ·临床疑似病料检测 | 第43页 |
| ·PRRSV 阳性样品各脏器检出率及符合率 | 第43页 |
| 3 讨论 | 第43-45页 |
| 第五章 CSF、PRRS 及JE 多重实时荧光定量RT-PCR 诊断方法的建立 | 第45-51页 |
| 1 材料与方法 | 第45-46页 |
| ·实时荧光定量RT-PCR 检测方法的建立 | 第45-46页 |
| ·病毒基因组RNA 的提取 | 第45页 |
| ·One-Step RT-PCR 扩增用于体外转录的目的基因片段 | 第45页 |
| ·体外转录RNA 标准品模板的制备 | 第45-46页 |
| ·一步法实时荧光定量RT-PCR 检测方法的建立 | 第46页 |
| 2 结果 | 第46-50页 |
| ·CSFV 和JEV 二重RQ-PCR 动力学扩增曲线 | 第46页 |
| ·CSFV 和JEV 二重RQ-PCR 敏感性及标准曲线 | 第46-47页 |
| ·PRRSV 和JEV 二重RQ-PCR 动力学扩增曲线 | 第47页 |
| ·CSFV 和PRRSV 二重RQ-PCR 动力学扩增曲线 | 第47-48页 |
| ·CSFV、PRRSV 和JEV 三重RQ-PCR 动力学扩增曲线 | 第48-49页 |
| ·CSFV、PRRSV 和JEV 三重RQ-PCR 敏感性试验 | 第49-50页 |
| 3 讨论 | 第50-51页 |
| 结论 | 第51-52页 |
| 致谢 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-59页 |
| 作者简介 | 第59-60页 |
| 导师简介 | 第60-61页 |
