| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 前言 | 第11-20页 |
| 1 文献综述 | 第11-17页 |
| ·脂氢过氧化物裂解酶 | 第11-16页 |
| ·脂氢过氧化物裂解酶代谢途径 | 第11-12页 |
| ·脂氢过氧化物裂解酶(HPL)基因的分离 | 第12-13页 |
| ·植物HPL催化产物的生理功能 | 第13-15页 |
| ·作为植物芳香物质的组成部分 | 第13页 |
| ·参与植株防御反应 | 第13页 |
| ·作为植株信号分子 | 第13-15页 |
| ·对物种间关系的影响 | 第15-16页 |
| ·产业化利用 | 第16页 |
| ·对人体机能的影响 | 第16页 |
| ·蔬菜风味物质的主要成分 | 第16-17页 |
| 2 目的和意义 | 第17-19页 |
| 3 研究方法与技术路线 | 第19-20页 |
| 第一章 HPL基因的克隆 | 第20-41页 |
| 1 试验材料 | 第20-21页 |
| ·植物材料 | 第20页 |
| ·酶和试剂 | 第20页 |
| ·培养基 | 第20页 |
| ·载体和菌株 | 第20页 |
| ·试验器具和耗材 | 第20-21页 |
| ·仪器与设备 | 第21页 |
| 2 试验方法 | 第21-27页 |
| ·枸橘总RNA的提取 | 第21-22页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第22页 |
| ·枸橘HPL基因片段DNA克隆 | 第22-23页 |
| ·引物设计 | 第22页 |
| ·DNA的PCR扩增 | 第22-23页 |
| ·目的片段的回收、连接、转化以及重组质粒的筛选与鉴定 | 第23-25页 |
| ·目的片断的回收(多功能DNA回收纯化试剂盒) | 第23页 |
| ·目的片段与pMD18-T Vector的连接 | 第23页 |
| ·大肠杆菌TOP10感受态细胞的制CaCl_2法 | 第23-24页 |
| ·感受态细胞的转化 | 第24页 |
| ·重组质粒的筛选与鉴定 | 第24-25页 |
| ·枸橘HPL基因的cDNA保守区的扩增 | 第25-26页 |
| ·引物设计 | 第25页 |
| ·保守区cDNA的PCR扩增 | 第25-26页 |
| ·果实特异性启动子RJ39的PCR扩增 | 第26-27页 |
| ·引物设计 | 第26页 |
| ·PCR扩增 | 第26-27页 |
| 3 结果与分析 | 第27-40页 |
| ·枸橘叶片总RNA的提取 | 第27页 |
| ·枸橘HPL基因cDNA保守区的克隆与序列分析 | 第27-37页 |
| ·枸橘HPL蛋白质三级结构预测 | 第37-39页 |
| ·获得果实特异性启动子RJ39 | 第39-40页 |
| 4 讨论 | 第40-41页 |
| 第二章 植物表达载体的构建 | 第41-57页 |
| 1 试验材料 | 第41-42页 |
| ·酶和试剂 | 第41页 |
| ·菌种与表达载体 | 第41页 |
| ·仪器与设备 | 第41-42页 |
| 2 试验方法 | 第42-47页 |
| ·菌种活化 | 第42页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第42-43页 |
| ·中间表达载体的构建 | 第43-44页 |
| ·表达载体pCAMBIA3300-35S-HPL的构建 | 第43-44页 |
| ·质粒pCAMBIA3300-35S-Tnos和PMD18-HPL-T的酶切与回收 | 第43页 |
| ·载体pCAMBIA3300-35S片段和HPL基因片段的连接、转化 | 第43-44页 |
| ·表达载体pCAMBIA2300-35S-Tnos的构建 | 第44页 |
| ·质粒pCAMBIA3300-35S-Tnos和pCAMBIA2300的酶切与回收 | 第44页 |
| ·载体pCAMBIA2300片段和35S-Tnos基因片段的连接、转化 | 第44页 |
| ·重组载体pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos的构建 | 第44-45页 |
| ·质粒pCAMBIA2300-35S-Tnos和pCAMBIA3300-35S-HPL的酶切与回收 | 第44-45页 |
| ·载体pCAMBIA2300-Tnos片段和35S-HPL基因片段的连接、转化 | 第45页 |
| ·重组载体pCAMBIA2300-RJ39-HPL-Tnos的构建 | 第45-46页 |
| ·质粒pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos和PMT18-RJ39-T的酶切与回收 | 第45页 |
| ·载体pCAMBIA2300-HPL-Tnos和RJ39基因片段的连接、转化 | 第45-46页 |
| ·重组质粒的检测 | 第46-47页 |
| 3 结果与分析 | 第47-56页 |
| ·pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos表达载体的构建 | 第47-51页 |
| ·pCAMBIA2300-RJ39-HPL-Tnos表达载体的构建 | 第51-53页 |
| ·阳性菌落的PCR检测 | 第53-54页 |
| ·酶切鉴定载体pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos和载体pCAMBIA2300-RJ -HPL-Tnos | 第54-56页 |
| 4 讨论 | 第56-57页 |
| 第三章 HPL基因在生菜和草莓中的表达 | 第57-74页 |
| 1 实验材料 | 第57-58页 |
| ·植物材料 | 第57页 |
| ·菌株和表达载体 | 第57页 |
| ·酶和试剂 | 第57页 |
| ·仪器和耗材 | 第57-58页 |
| ·培养基 | 第58页 |
| ·细菌培养基 | 第58页 |
| ·植物培养基 | 第58页 |
| 2 试验方法 | 第58-65页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第58-59页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备 | 第58-59页 |
| ·冻融法转化农杆菌 | 第59页 |
| ·农杆菌转化子鉴定 | 第59页 |
| ·kan筛选浓度的确定 | 第59页 |
| ·农杆菌转化叶盘 | 第59-60页 |
| ·转基因植株的鉴定 | 第60-61页 |
| ·Kan抗性分析 | 第60页 |
| ·转基因植株DNA的提取 | 第60-61页 |
| ·农杆菌质粒DNA的提取 | 第61页 |
| ·外源基因的PCR检测 | 第61页 |
| ·试管苗的移栽 | 第61页 |
| ·转基因植株的Southern杂交检测 | 第61-63页 |
| ·探针标记 | 第61-62页 |
| ·转基因株系基因组DNA的提取 | 第62页 |
| ·酶切及电泳 | 第62页 |
| ·转膜与固定 | 第62页 |
| ·杂交 | 第62-63页 |
| ·免疫检测 | 第63页 |
| ·转基因植株的RT-PCR检测 | 第63-64页 |
| ·转基因植株的Northern杂交检测 | 第64-65页 |
| ·探针标记 | 第64页 |
| ·转基因株系基因组RNA的提取 | 第64页 |
| ·电泳 | 第64页 |
| ·转膜 | 第64页 |
| ·杂交 | 第64-65页 |
| ·免疫检测 | 第65页 |
| 3 结果与分析 | 第65-72页 |
| ·表达载体pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos和pCAMBIA2300-RJ39-HPL-Tnos转化农杆菌 | 第65-67页 |
| ·Kan筛选浓度的确定 | 第67-68页 |
| ·转基因植株的检测 | 第68-72页 |
| ·转基因植株的PCR鉴定 | 第68-70页 |
| ·Southern印记杂交鉴定 | 第70-71页 |
| ·转基因植株的RT-PCR鉴定 | 第71页 |
| ·转基因植株杂交鉴定 | 第71-72页 |
| 4 讨论 | 第72-74页 |
| ·农杆菌菌株对遗传转化的影响 | 第72页 |
| ·农杆菌菌液浓度和侵染时间对遗传转化的影响 | 第72页 |
| ·侵染植株的选择 | 第72-73页 |
| ·HPL基因对植株的转化 | 第73-74页 |
| 第四章 结论和展望 | 第74-75页 |
| 1 结论 | 第74页 |
| 2 展望 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-81页 |
| 附录1：枸橘 | 第81-82页 |
| 附录2：P3300-35S-HPL中间表达载体的构建 | 第82-83页 |
| 附录3：PCAMBIA2300-35S-Tnos中间表达载体的构建 | 第83-84页 |
| 附录4：pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos表达载体的构建 | 第84-85页 |
| 附录5：pCAMBIA2300-RJ39-HPL-Tnos表达载体的构建 | 第85-86页 |
| 附录6：生菜kan浓度的确定 | 第86-87页 |
| 附录7：草莓kan浓度的确定 | 第87-88页 |
| 附录8：农杆菌转化生菜 | 第88-89页 |
| 附录9：农杆菌转化草莓 | 第89-90页 |
| 附录10：主要缩略词表 | 第90-91页 |
| 致谢 | 第91页 |
