| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-10页 |
| 目录 | 第10-14页 |
| 第一部分 嗜热脱氮土壤芽胞杆菌 NG80-2 长链烷烃羟化酶 LadA 的体外定向进化 | 第14-126页 |
| 第一章 引言 | 第14-77页 |
| 第一节 研究背景简介 | 第14-74页 |
| ·石油微生物的应用和研究进展 | 第14-18页 |
| ·土壤芽胞杆菌属的研究进展 | 第18-22页 |
| ·嗜热脱氮土壤芽胞杆菌 NG80-2 的研究意义和背景 | 第22-37页 |
| ·微生物长链烷烃降解途径研究进展 | 第37-50页 |
| ·微生物烷烃羟化酶的研究进展 | 第50-58页 |
| ·酶分子的体外定向进化研究进展 | 第58-74页 |
| 第二节 本研究的立题依据、研究内容和创新性 | 第74-77页 |
| ·本研究的立题依据 | 第74-75页 |
| ·本研究的研究内容 | 第75页 |
| ·本研究的创新性 | 第75-77页 |
| 第二章 材料与方法 | 第77-102页 |
| 第一节 实验材料 | 第77-84页 |
| ·菌株 | 第77-79页 |
| ·质粒 | 第79-82页 |
| ·引物 | 第82-83页 |
| ·主要酶与试剂 | 第83-84页 |
| 第二节 实验方法 | 第84-102页 |
| ·培养基及试剂配方 | 第84-85页 |
| ·载体质粒 DNA 的提取 | 第85-86页 |
| ·目的基因的扩增及纯化 | 第86-87页 |
| ·PCR 产物和载体的酶切 | 第87-88页 |
| ·双酶切产物的连接 | 第88页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第88-90页 |
| ·连接产物及重组质粒电转化入感受态细胞 | 第90页 |
| ·质粒的酶切鉴定 | 第90页 |
| ·插入片段序列测定 | 第90页 |
| ·蛋白的 SDS-PAGE 和 native-PAGE 电泳 | 第90-91页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第91页 |
| ·在大肠杆菌 BL21 中小量诱导表达重组蛋白 | 第91-92页 |
| ·在大肠杆菌 BL21 中大量表达和纯化重组蛋白 | 第92-95页 |
| ·序列分析和进化分析 | 第95页 |
| ·突变文库的筛选 | 第95-96页 |
| ·易错 PCR 定向进化 LadA | 第96-97页 |
| ·定点饱和突变定向进化 LadA | 第97-98页 |
| ·LadA 酶活性分析 | 第98-101页 |
| ·体内互补实验 | 第101页 |
| ·同源建模和分子对接分析 | 第101-102页 |
| 第三章 实验结果 | 第102-121页 |
| 第一节 定向进化 LadA | 第102-107页 |
| ·易错 PCR 定向进化 | 第102-106页 |
| ·突变位点拆分组合实验 | 第106页 |
| ·定向饱和突变进化 | 第106-107页 |
| 第二节 LadA 突变体酶学性质分析 | 第107-113页 |
| ·突变酶的表达和纯化 | 第107-108页 |
| ·突变酶的底物消耗测定 | 第108-109页 |
| ·突变酶的动力学参数分析 | 第109-110页 |
| ·突变酶最适温度分析 | 第110-111页 |
| ·突变酶最适 pH 分析 | 第111-112页 |
| ·突变酶热稳定性分析 | 第112-113页 |
| ·突变酶底物范围分析 | 第113页 |
| 第三节 LadA 突变体突变位点分析 | 第113-119页 |
| ·突变酶同源模建 | 第113-114页 |
| ·突变位点分析 | 第114-118页 |
| ·突变酶与底物分子模拟对接 | 第118-119页 |
| 第四节 LadA 突变体的体内互补实验 | 第119-121页 |
| 第四章 讨论与分析 | 第121-124页 |
| 第一节 突变方法的选择 | 第121页 |
| 第二节 易错 PCR 突变率的确定 | 第121-122页 |
| 第三节 突变文库大小的确定 | 第122页 |
| 第四节 结构分析的一些启示 | 第122-123页 |
| 第五节 其它 | 第123-124页 |
| 第五章 结论与展望 | 第124-126页 |
| 第二部分 NG80-2 长链脂肪酸辅酶 A 连接酶 Facl 功能鉴定 | 第126-158页 |
| 第一章 引言 | 第126-140页 |
| 第一节 研究背景简介 | 第126-138页 |
| ·微生物极端酶的研究进展 | 第126-128页 |
| ·长链脂肪酸辅酶 A 连接酶的研究进展 | 第128-138页 |
| 第二节 本研究的立题依据、研究内容和创新性 | 第138-140页 |
| ·本研究的立题依据 | 第138页 |
| ·本研究的研究内容 | 第138-139页 |
| ·本研究的创新性 | 第139-140页 |
| 第二章 材料与方法 | 第140-147页 |
| 第一节 实验材料 | 第140-143页 |
| ·菌株 | 第140-141页 |
| ·质粒 | 第141页 |
| ·引物 | 第141-142页 |
| ·主要酶与试剂 | 第142-143页 |
| 第二节 实验方法 | 第143-147页 |
| ·培养基及试剂配方 | 第143页 |
| ·细菌基因组 DNA 的提取 | 第143-144页 |
| ·质粒 DNA 的提取 | 第144页 |
| ·目的基因的扩增及纯化 | 第144页 |
| ·PCR 产物和载体的酶切 | 第144页 |
| ·双酶切产物的连接 | 第144页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第144页 |
| ·连接产物及重组质粒电转化入感受态细胞 | 第144页 |
| ·插入片段序列测定 | 第144页 |
| ·蛋白的 SDS-PAGE 和 native-PAGE 电泳 | 第144页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第144页 |
| ·在大肠杆菌 BL21 中小量诱导表达重组蛋白 | 第144-145页 |
| ·在大肠杆菌 BL21 中大量表达和纯化重组蛋白 | 第145页 |
| ·序列分析和进化分析 | 第145页 |
| ·Facl 酶活性分析 | 第145-146页 |
| ·Real-time RT-PCR 实验 | 第146-147页 |
| 第三章 实验结果 | 第147-155页 |
| 第一节 Facl1 和 Facl2 的克隆表达和功能鉴定 | 第147-152页 |
| ·Facl1 和 Facl2 的克隆表达 | 第147-148页 |
| ·Facl1 和 Facl2 底物范围测定 | 第148页 |
| ·Facl1 和 Facl2 动力学参数的测定 | 第148-149页 |
| ·Facl1 和 Facl2 最适反应温度的测定 | 第149页 |
| ·Facl1 和 Facl2 最适 pH 的测定 | 第149-150页 |
| ·Facl1 和 Facl2 热稳定性分析 | 第150-151页 |
| ·金属离子，EDTA，SDS 和 Triton X-100 对 Facl1 和 Facl2 活性的影响 | 第151-152页 |
| ·Facl1 和 Facl2 的 Real-time RT-PCR 分析 | 第152页 |
| 第二节 NG80-2 中其它的 Facl 酶 | 第152-155页 |
| ·NG80-2 中其它 Facl 酶的克隆表达 | 第152-154页 |
| ·NG80-2 中其它 Facl 酶的底物范围测定 | 第154-155页 |
| 第四章 讨论与分析 | 第155-157页 |
| 第五章 结论与展望 | 第157-158页 |
| 参考文献 | 第158-171页 |
| 致谢 | 第171-172页 |
| 附录（个人简历 攻读博士期间发表的学术论文与研究成果） | 第172-174页 |
