| 中文摘要 | 第1-9页 |
| 英文摘要 | 第9-14页 |
| 符号说明 | 第14-16页 |
| 前言 | 第16-20页 |
| 技术路线 | 第20-21页 |
| 第一部分 hTERT启动子靶向性转录活性测定及其调控的TRAIL基因表达载体的构建 | 第21-40页 |
| 材料与方法 | 第21-32页 |
| 1. 材料 | 第21-23页 |
| ·质粒、菌株与细胞株 | 第21页 |
| ·主要试剂 | 第21页 |
| ·一般试剂 | 第21-23页 |
| ·主要实验仪器 | 第23页 |
| 2. 方法 | 第23-32页 |
| ·phTERTlucl、pGL3-Control、pGL3-Basic的转化、扩增与提取 | 第23-25页 |
| ·E.coli JM109感受态的制备 | 第24页 |
| ·质粒的转化 | 第24页 |
| ·试剂盒小量提取质粒 | 第24-25页 |
| ·细胞的培养、冻存和复苏 | 第25-27页 |
| ·细胞的培养 | 第25-26页 |
| ·细胞冻存 | 第26页 |
| ·细胞的复苏 | 第26-27页 |
| ·hTERT启动子靶向性转录活性的检测 | 第27-28页 |
| ·脂质体转染 | 第27页 |
| ·细胞的收集 | 第27-28页 |
| ·荧光素酶表达量的测定 | 第28页 |
| ·构建重组载体phTERT-TRAIL和阳性对照载体pSV40-TRAIL | 第28-32页 |
| ·引物设计及PCR扩增目的基因TRAIL | 第28-30页 |
| ·重组载体phTERT-TRAIL的构建 | 第30-31页 |
| ·阳性对照载体pSV40-TRAIL的构建 | 第31-32页 |
| 结果 | 第32-33页 |
| 1. 荧光素酶活性测定分析hTERT启动子靶向性的转录活性 | 第32页 |
| 2. 重组载体构建流程图 | 第32页 |
| 3. PCR扩增TRAIL基因 | 第32页 |
| 4. 重组载体phTERT-TRAIL和阳性对照载体pSV40-TRAIL的构建 | 第32-33页 |
| 讨论 | 第33-40页 |
| 1. 荧光素酶活性的测定 | 第33-37页 |
| ·双荧光素酶报告基因测试系统 | 第33-34页 |
| ·pGL3荧光素酶报告基因载体 | 第34-35页 |
| ·荧光素酶活性测定分析hTERT启动子靶向性的转录活性 | 第35-37页 |
| ·端粒酶及其分布特点 | 第35-36页 |
| ·hTERT启动子的基因结构特点及其活性调控机制 | 第36-37页 |
| ·hTERT启动子的研究价值及其在乳腺癌中的应用前景 | 第37页 |
| 2. TRAIL及TRAIL基因表达载体的构建 | 第37-40页 |
| 第二部分 外源TRAIL基因在乳腺癌细胞MCF-7/ADR中特异性表达及特异性诱导凋亡的研究 | 第40-58页 |
| 材料与方法 | 第40-48页 |
| 1. 材料 | 第40-41页 |
| ·质粒、细胞株 | 第40页 |
| ·主要试剂 | 第40页 |
| ·一般试剂 | 第40-41页 |
| ·主要仪器 | 第41页 |
| 2. 方法 | 第41-48页 |
| ·脂质体转染及转染率的检测 | 第41-42页 |
| ·hTERT启动子调控的外源基因TRAIL靶向MCF-7/ADR细胞表达的检测 | 第42-47页 |
| ·脂质体转染 | 第42页 |
| ·半定量RT-PCR检测各组细胞TRAIL mRNA水平的表达 | 第42-44页 |
| ·蛋白质印迹试验检测TRAIL蛋白水平的表达 | 第44-47页 |
| ·FCM检测各组细胞TRAIL蛋白水平的表达 | 第47页 |
| ·hTERT启动子调控的TRAIL基因特异性诱导细胞凋亡的检测 | 第47-48页 |
| ·脂质体转染 | 第47页 |
| ·形态学观察 | 第47页 |
| ·PI染色法 | 第47页 |
| ·AnnexinV-FITC/PI法 | 第47-48页 |
| 结果 | 第48-51页 |
| 1. 脂质体介导的转染率 | 第48页 |
| 2. TRAIL基因表达的检测 | 第48-49页 |
| ·半定量RT-PCR检测TRAIL mRNA的表达水平 | 第48-49页 |
| ·Western blotting检测转染细胞TRAIL蛋白水平的表达 | 第49页 |
| ·FCM检测转染细胞TRAIL蛋白水平的表达 | 第49页 |
| 3. 转染细胞凋亡情况的检测 | 第49-51页 |
| ·外源基因TRAIL转染细胞后的光镜下观察细胞形态学变化 | 第49-50页 |
| ·FCM的PI染色法检测TRAIL诱导的细胞凋亡 | 第50页 |
| ·FCM的Annexin V-FITC/PI双标法检测TRAIL诱导MCF-7/ADR细胞的早期凋亡 | 第50-51页 |
| 讨论 | 第51-57页 |
| 1. 脂质体转染 | 第51页 |
| 2. 重组载体phTERT-TRAIL在端粒酶阳性细胞中的特异性表达 | 第51-52页 |
| 3 肿瘤靶向性载体特异性诱导乳腺癌细胞的凋亡 | 第52-57页 |
| ·TRAIL引起的凋亡通路及其调节机制 | 第52-54页 |
| ·TRAIL基因治疗存在的负面效应及重组载体phTERT-TRAIL构建的意义 | 第54页 |
| ·FCM检测凋亡 | 第54-57页 |
| 小结 | 第57-58页 |
| 附图 | 第58-72页 |
| 参考文献 | 第72-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文及编著目录 | 第82-83页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第83页 |
