| 摘要 | 第14-16页 |
| Abstract | 第16-17页 |
| 缩略词 | 第18-19页 |
| 第一章 前言 | 第19-33页 |
| 1.1 烟草 | 第19-26页 |
| 1.1.1 烟草的进化与分类 | 第19-21页 |
| 1.1.2 烟草的基因组 | 第21-22页 |
| 1.1.3 烟草腺毛 | 第22页 |
| 1.1.4 腺毛分泌物(西柏烷烃) | 第22-26页 |
| 1.2 转录因子 | 第26-31页 |
| 1.2.1 MYB转录因子 | 第27-30页 |
| 1.2.2 WRKY转录因子 | 第30-31页 |
| 1.3 DUF基因家族的相关研究 | 第31-32页 |
| 1.4 本研究的目的和意义 | 第32-33页 |
| 第二章 材料与方法 | 第33-69页 |
| 2.1 实验材料 | 第33-38页 |
| 2.1.1 烟草材料 | 第33页 |
| 2.1.2 载体质粒与菌株 | 第33-35页 |
| 2.1.2.1 载体质粒 | 第33-34页 |
| 2.1.2.2 载体图谱 | 第34-35页 |
| 2.1.2.3 菌株 | 第35页 |
| 2.1.3 主要酶类、试剂盒及仪器 | 第35-38页 |
| 2.1.3.1 酶类 | 第35-36页 |
| 2.1.3.2 试剂盒 | 第36页 |
| 2.1.3.3 抗生素 | 第36-37页 |
| 2.1.3.4 其他试剂 | 第37页 |
| 2.1.3.5 仪器 | 第37-38页 |
| 2.2 实验方法 | 第38-69页 |
| 2.2.1 烟草材料的生长和处理 | 第38-40页 |
| 2.2.1.1 烟草无菌苗的获得——种子的消毒 | 第38-39页 |
| 2.2.1.2 组织表达谱的取样 | 第39页 |
| 2.2.1.3 烟草幼苗的激素处理方法 | 第39-40页 |
| 2.2.2 基本培养基的配制 | 第40-41页 |
| 2.2.3 烟草叶片的瞬时转化 | 第41-42页 |
| 2.2.3.1 本氏烟的栽培 | 第41页 |
| 2.2.3.2 本氏烟的瞬时转化方法 | 第41-42页 |
| 2.2.3.3 相关溶液的配制 | 第42页 |
| 2.2.4 激光共聚焦扫描观察 | 第42页 |
| 2.2.5 农杆菌介导的烟草遗传转化 | 第42-43页 |
| 2.2.6 GUS组织化学分析 | 第43-44页 |
| 2.2.6.1 GUS染色液的配制 | 第43-44页 |
| 2.2.6.2 组织染色步骤 | 第44页 |
| 2.2.7 扫描电镜观察 | 第44-45页 |
| 2.2.7.1 具体步骤 | 第44-45页 |
| 2.2.7.2 固定液的配制 | 第45页 |
| 2.2.8 罗丹明染色 | 第45页 |
| 2.2.9 生物信息学分析 | 第45-46页 |
| 2.2.10 烟草基因组DNA的提取 | 第46-47页 |
| 2.2.10.1 具体步骤 | 第46页 |
| 2.2.10.2 溶液配制 | 第46-47页 |
| 2.2.11 烟草总RNA的提取 | 第47-48页 |
| 2.2.12 RNA样品中基因组DNA的去除 | 第48页 |
| 2.2.13 cDNA第一链的合成 | 第48-49页 |
| 2.2.14 PCR技术 | 第49-53页 |
| 2.2.14.1 普通taq酶PCR | 第49-50页 |
| 2.2.14.2 高保真酶PCR | 第50页 |
| 2.2.14.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) | 第50-52页 |
| 2.2.14.4 荧光定量PCR及普通PCR检测所用引物 | 第52-53页 |
| 2.2.15 DNA片段的回收 | 第53-54页 |
| 2.2.15.1 DNA的凝胶回收 | 第53-54页 |
| 2.2.15.2 PCR/酶切产物的回收 | 第54页 |
| 2.2.16 DNA的酶切 | 第54页 |
| 2.2.17 DNA片段的去磷酸化 | 第54-55页 |
| 2.2.18 DNA片段加A尾 | 第55页 |
| 2.2.19 DNA连接反应 | 第55页 |
| 2.2.20 Gateawy克隆系统 | 第55-57页 |
| 2.2.20.1 BP反应 | 第55-56页 |
| 2.2.20.2 LR反应 | 第56-57页 |
| 2.2.21 In-Fusion无缝连接 | 第57-58页 |
| 2.2.22 质粒的提取 | 第58-59页 |
| 2.2.23 感受态的制备 | 第59-60页 |
| 2.2.23.1 大肠杆菌热激化感受态 | 第59-60页 |
| 2.2.23.2 农杆菌热激化感受态的制备 | 第60页 |
| 2.2.24 感受态细胞的转化 | 第60-61页 |
| 2.2.24.1 大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第60页 |
| 2.2.24.2 农杆菌感受态细胞的转化 | 第60-61页 |
| 2.2.25 烟草遗传转化载体的构建 | 第61-63页 |
| 2.2.25.1 组织定位表达载体的构建 | 第61页 |
| 2.2.25.2 过表达、亚细胞定位载体的构建 | 第61-62页 |
| 2.2.25.3 RNAi抑制表达载体的构建 | 第62-63页 |
| 2.2.26 转基因植株鉴定 | 第63页 |
| 2.2.27 酵母自激活实验 | 第63-66页 |
| 2.2.27.1 原理 | 第63-64页 |
| 2.2.27.2 载体构建 | 第64页 |
| 2.2.27.3 自激活实验 | 第64-66页 |
| 2.2.28 数字基因表达谱测序(DGE) | 第66-69页 |
| 2.2.28.1 样品制备 | 第66页 |
| 2.2.28.2 测序流程 | 第66-68页 |
| 2.2.28.3 分析流程 | 第68-69页 |
| 第三章 Nt21基因的功能研究 | 第69-97页 |
| 3.1 Nt21生物信息学分析 | 第69-73页 |
| 3.1.1 Nt21的分子遗传进化 | 第69-71页 |
| 3.1.2 Nt21基因及蛋白序列的分析 | 第71-73页 |
| 3.2 Nt21亚细胞定位分析 | 第73-74页 |
| 3.2.1 Nt21亚细胞定位载体的构建 | 第73页 |
| 3.2.2 Nt21蛋白的定位 | 第73-74页 |
| 3.3 Nt21蛋白的自激活活性检测 | 第74-77页 |
| 3.3.1 BD载体的构建(pGBKT7-Nt21F) | 第74-75页 |
| 3.3.2 Nt21蛋白自激活活性检测 | 第75-77页 |
| 3.3.2.1 Nt21全长自激活活性检测 | 第75页 |
| 3.3.2.2 Nt21蛋白自激活结构域验证 | 第75-77页 |
| 3.4 Nt21的表达模式分析 | 第77-82页 |
| 3.4.1 Nt21启动子区顺式作用元件的预测 | 第77-78页 |
| 3.4.2 Nt21的组织表达模式分析 | 第78-82页 |
| 3.4.2.1 qRT-PCR分析Nt21的组织表达模式 | 第78-79页 |
| 3.4.2.2 Nt21组织定位表达载体的构建 | 第79-80页 |
| 3.4.2.3 Nt21启动子融合GUS表达的转基因烟草鉴定 | 第80-81页 |
| 3.4.2.4 Nt21的组织表达模式 | 第81页 |
| 3.4.2.5 ABA处理下Nt21的表达模式 | 第81-82页 |
| 3.5 Nt21转基因烟草的表型分析 | 第82-91页 |
| 3.5.1 Nt21表达载体的构建 | 第82-84页 |
| 3.5.1.1 Nt21过表达载体的构建(pCXSN-HA-Nt21) | 第82-83页 |
| 3.5.1.2 Nt21干扰表达载体的构建(pH7GWIWG2(Ⅱ)-Nt21) | 第83-84页 |
| 3.5.2 Nt21转基因烟草的鉴定 | 第84-85页 |
| 3.5.2.1 Nt21过表达转基因烟草的鉴定 | 第84-85页 |
| 3.5.2.2 Nt21 RNAi干扰转基因烟草的鉴定 | 第85页 |
| 3.5.3 转基因烟草中Nt21的表达水平 | 第85-87页 |
| 3.5.3.1 qRT-PCR检测T_0代过表达转基因烟草中Nt21的表达水平 | 第85-86页 |
| 3.5.3.2 qRT-PCR检测T_0代RNAi干扰转基因烟草中Nt21的表达水平 | 第86-87页 |
| 3.5.4 转基因烟草中烷烃类合成相关Maker基因的检测 | 第87-90页 |
| 3.5.4.1 qRT-PCR检测T_0代过表达转基因烟草中CYC/CYP的表达水平 | 第87-88页 |
| 3.5.4.2 qRT-PCR检测T_o代RNAi转基因烟草中CYC/CYP的表达水平 | 第88-90页 |
| 3.5.5 Nt21转基因烟草叶片的显微观察 | 第90-91页 |
| 3.6 Nt21过表达转基因植株的数字表达谱分析(DGE) | 第91-97页 |
| 3.6.1 RNA样品质检 | 第91-92页 |
| 3.6.2 GO富集分析 | 第92-96页 |
| 3.6.3 KEGG pathway分析 | 第96-97页 |
| 第四章 Nt92基因功能研究 | 第97-123页 |
| 4.1 Nt92生物信息学分析 | 第97-101页 |
| 4.1.1 DUF868家族特征及序列分析 | 第97-99页 |
| 4.1.2 烟草DUF868基因 | 第99-100页 |
| 4.1.3 Nt92基因及蛋白序列的分析 | 第100-101页 |
| 4.2 Nt92亚细胞定位分析 | 第101-103页 |
| 4.2.1 Nt92亚细胞定位表达载体的构建 | 第101-102页 |
| 4.2.2 Nt92蛋白的定位 | 第102-103页 |
| 4.3 Nt92蛋白的自激活活性检测 | 第103-104页 |
| 4.3.1 BD载体的构建(pGBKT7-Nt92) | 第103页 |
| 4.3.2 Nt92蛋白自激活活性检测 | 第103-104页 |
| 4.4 Nt92的表达模式分析 | 第104-109页 |
| 4.4.1 Nt92启动子区顺式作用元件的预测 | 第104-106页 |
| 4.4.2 Nt92的组织表达模式分析 | 第106-109页 |
| 4.4.2.1 qRT-PCR分析Nt92的组织表达模式 | 第106页 |
| 4.4.2.2 Nt92组织定位表达载体的构建 | 第106-107页 |
| 4.4.2.3 Nt92启动子融合GUS表达的转基因烟草鉴定 | 第107-108页 |
| 4.4.2.4 Nt92的组织表达模式 | 第108-109页 |
| 4.5 Nt92转基因的表型分析 | 第109-116页 |
| 4.5.1 Nt92表达载体的构建 | 第109-110页 |
| 4.5.1.1 Nt92过表达载体的构建(pCXSN-Myc-Nt92) | 第109-110页 |
| 4.5.1.2 Nt92干扰表达载体的构建(pH7GWIWG2(Ⅱ)-Nt92) | 第110页 |
| 4.5.2 Nt92转基因烟草植株的鉴定 | 第110-112页 |
| 4.5.2.1 Nt92过表达转基因烟草的鉴定 | 第110-111页 |
| 4.5.2.2 Nt92 RNAi干扰转基因烟草的鉴定 | 第111-112页 |
| 4.5.3 转基因烟草中Nt92的表达水平 | 第112-113页 |
| 4.5.3.1 qRT-PCR检测T_0代过表达转基因烟草中Nt92的表达水平 | 第112页 |
| 4.5.3.2 qRT-PCR检测T_0代RNA干扰转基因烟草中Nt92的表达水平 | 第112-113页 |
| 4.5.4 转基因烟草中烷烃类合成相关Maker基因的检测 | 第113-116页 |
| 4.5.4.1 qRT-PCR检测T_0代过表达转基因烟草中CYC/CYP的表达水平 | 第113-115页 |
| 4.5.4.2 qRT-PCR检测T_0代RNAi转基因烟草中CYC/CYP的表达水平 | 第115-116页 |
| 4.6 Nt92过表达转基因植株的数字表达谱分析(DGE) | 第116-123页 |
| 4.6.1 GO富集分析 | 第116-118页 |
| 4.6.2 KEGG-pathway分析 | 第118-123页 |
| 第五章 讨论 | 第123-138页 |
| 5.1 Nt21基因功能分析 | 第123-136页 |
| 5.1.1 Nt21的组织表达特异性 | 第123-124页 |
| 5.1.2 Nt21蛋白的定位 | 第124-128页 |
| 5.1.3 Nt21蛋白的自激活验证 | 第128-130页 |
| 5.1.4 Nt21转基因植株的表型分析 | 第130页 |
| 5.1.5 Nt21过表达转基因植株的数字表达谱 | 第130-136页 |
| 5.2 Nt92基因功能分析 | 第136-138页 |
| 5.2.1 Nt92的组织表达特异性 | 第136页 |
| 5.2.2 Nt92蛋白的定位与自激活验证 | 第136页 |
| 5.2.3 Nt92转基因植株的表型分析 | 第136-137页 |
| 5.2.4 Nt92过表达转基因植株的数字表达谱 | 第137-138页 |
| 第六章 总结 | 第138-140页 |
| 6.1 Nt21 | 第138-139页 |
| 6.2 Nt92 | 第139-140页 |
| 致谢 | 第140-141页 |
| 参考文献 | 第141-145页 |
