| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 前言 | 第13-26页 |
| 1 松杉灵芝概述 | 第13-14页 |
| 1.1 松杉灵芝简介 | 第13页 |
| 1.2 生物学特性 | 第13-14页 |
| 1.2.1 形态特征 | 第13页 |
| 1.2.2 生长特性 | 第13-14页 |
| 2 漆酶概述 | 第14-15页 |
| 2.1 漆酶简介 | 第14页 |
| 2.2 漆酶在真菌中的生物功能 | 第14-15页 |
| 2.3 真菌漆酶基因研究 | 第15页 |
| 3 扩增未知序列DNA片段的PCR技术 | 第15-18页 |
| 3.1 TAIL-PCR技术 | 第15-17页 |
| 3.2 SEFA-PCR技术 | 第17-18页 |
| 4 基因敲除技术 | 第18-21页 |
| 4.1 随机插入突变技术 | 第19页 |
| 4.2 RNA干扰技术 | 第19-20页 |
| 4.3 同源重组技术 | 第20-21页 |
| 5 真菌遗传转化方法 | 第21-24页 |
| 5.1 电激介导法 | 第22页 |
| 5.2 农杆菌介导法 | 第22-23页 |
| 5.3 限制性内切酶介导法 | 第23页 |
| 5.4 PEG-CaCl_2介导法 | 第23-24页 |
| 6 研究目的及意义 | 第24-26页 |
| 第一章 松杉灵芝原生质体单核化及不亲和因子测定 | 第26-33页 |
| 1 材料与方法 | 第26-28页 |
| 1.1 材料 | 第26-27页 |
| 1.1.1 供试菌株 | 第26页 |
| 1.1.2 培养基 | 第26页 |
| 1.1.3 试剂 | 第26-27页 |
| 1.1.4 仪器 | 第27页 |
| 1.2 实验方法与内容 | 第27-28页 |
| 1.2.1 原生质体制备 | 第27页 |
| 1.2.2 原生质体再生 | 第27页 |
| 1.2.3 再生菌株的挑取 | 第27页 |
| 1.2.4 单核菌株筛选 | 第27-28页 |
| 1.2.5 单核菌株生长速度测定 | 第28页 |
| 1.2.6 单核菌株配对及不亲和性因子测定 | 第28页 |
| 2 结果与分析 | 第28-31页 |
| 2.1 酶解时间对原生质体释放率的影响 | 第28-29页 |
| 2.2 原生质体再生 | 第29页 |
| 2.3 单核菌株获得结果 | 第29-30页 |
| 2.4 单核菌株生长速度测定结果 | 第30页 |
| 2.5 单核菌株不亲和性因子测定结果 | 第30-31页 |
| 3 小结与讨论 | 第31-33页 |
| 第二章 漆酶基因敲除供试菌株筛选及潮霉素抗性检测 | 第33-47页 |
| 1 材料与方法 | 第33-38页 |
| 1.1 材料 | 第33-35页 |
| 1.1.1 供试菌株与质粒 | 第33页 |
| 1.1.2 培养基 | 第33页 |
| 1.1.3 试剂 | 第33-34页 |
| 1.1.4 仪器 | 第34-35页 |
| 1.2 实验方法与内容 | 第35-38页 |
| 1.2.1 生长速度测定 | 第35页 |
| 1.2.2 RB-PDA平板脱色检测 | 第35页 |
| 1.2.3 粗酶液的制备及漆酶活性的测定 | 第35-36页 |
| 1.2.4 出菇实验 | 第36页 |
| 1.2.5 漆酶基因敲除供试菌株潮霉素抗性检测 | 第36页 |
| 1.2.6 漆酶基因敲除供试菌株潮霉素抗性基因表达 | 第36-38页 |
| 2 结果与分析 | 第38-45页 |
| 2.1 不同供试菌株生长速度测定结果 | 第38-39页 |
| 2.2 RB亮蓝平板脱色检测结果 | 第39页 |
| 2.3 漆酶酶活测定结果 | 第39-40页 |
| 2.4 瓶栽试验结果 | 第40-41页 |
| 2.5 漆酶基因敲除供试菌株潮霉素抗性检测结果 | 第41-42页 |
| 2.6 漆酶基因敲除供试菌株潮霉素抗性基因表达结果 | 第42-45页 |
| 2.6.1 质粒pCB1003提取结果 | 第42-43页 |
| 2.6.2 不同PEG浓度对转化效率的影响 | 第43页 |
| 2.6.3 转化子潮霉素平板筛选结果 | 第43-44页 |
| 2.6.4 转化子DNA提取结果 | 第44-45页 |
| 2.6.5 转化子PCR鉴定结果 | 第45页 |
| 3 小结与讨论 | 第45-47页 |
| 第三章 漆酶基因的敲除及转化子的鉴定 | 第47-66页 |
| 1 材料与方法 | 第47-54页 |
| 1.1 材料 | 第47页 |
| 1.1.1 漆酶基因序列、供试菌株与质粒 | 第47页 |
| 1.1.2 培养基 | 第47页 |
| 1.1.3 试剂 | 第47页 |
| 1.1.4 仪器 | 第47页 |
| 1.2 实验方法与内容 | 第47-54页 |
| 1.2.1 漆酶基因非编码序列扩增及回收测序 | 第47-51页 |
| 1.2.2 漆酶基因敲除盒构建 | 第51-53页 |
| 1.2.3 漆酶基因的敲除及转化子的鉴定 | 第53-54页 |
| 1.2.4 双核敲除菌株的获得 | 第54页 |
| 1.2.5 双核敲除菌株潮霉素抗性验证 | 第54页 |
| 1.2.6 拮抗实验 | 第54页 |
| 2 结果与分析 | 第54-64页 |
| 2.1 漆酶基因非编码序列的获得 | 第54-58页 |
| 2.1.1 漆酶基因5'端非编码序列的扩增 | 第54-55页 |
| 2.1.2 漆酶基因3'端非编码序列的扩增 | 第55-56页 |
| 2.1.3 扩增片段的回收纯化 | 第56-57页 |
| 2.1.4 阳性克隆的筛选 | 第57页 |
| 2.1.5 序列测定结果 | 第57-58页 |
| 2.2 漆酶基因敲除盒构建结果 | 第58-60页 |
| 2.2.1 漆酶基因片段扩增结果 | 第58-59页 |
| 2.2.2 潮霉素抗性基因片段扩增结果 | 第59页 |
| 2.2.3 构建漆酶基因敲除盒片段扩增结果 | 第59-60页 |
| 2.3 漆酶基因的敲除及转化子的鉴定结果 | 第60-62页 |
| 2.3.1 原生质体转化结果 | 第60-61页 |
| 2.3.2 敲除菌株潮霉素筛选结果 | 第61页 |
| 2.3.3 敲除菌株PCR验证结果 | 第61-62页 |
| 2.4 双核敲除菌株的获得及其潮霉素抗性验证结果 | 第62-63页 |
| 2.5 拮抗实验结果 | 第63-64页 |
| 3 小结与讨论 | 第64-66页 |
| 第四章 漆酶基因在松杉灵芝形态建成中功能的验证 | 第66-79页 |
| 1 材料与方法 | 第66-68页 |
| 1.1 材料 | 第66页 |
| 1.1.1 供试菌株 | 第66页 |
| 1.1.2 培养基 | 第66页 |
| 1.1.3 试剂 | 第66页 |
| 1.1.4 仪器 | 第66页 |
| 1.2 实验方法 | 第66-68页 |
| 1.2.1 生长速度测定 | 第66页 |
| 1.2.2 RB-PDA平板脱色检测 | 第66-67页 |
| 1.2.3 菌落及菌丝形态观察 | 第67页 |
| 1.2.4 粗酶液的制备及漆酶活性的测定 | 第67页 |
| 1.2.5 胞内漆酶活性测定 | 第67页 |
| 1.2.6 出菇试验 | 第67-68页 |
| 2 结果与分析 | 第68-77页 |
| 2.1 敲除菌株生长速度测定结果 | 第68-69页 |
| 2.2 RB亮蓝平板脱色检测结果 | 第69-70页 |
| 2.3 不同菌株菌落及菌丝形态观察 | 第70-72页 |
| 2.3.1 不同菌种菌落形态观察结果 | 第70-71页 |
| 2.3.2 敲除菌株菌丝形态观察结果 | 第71-72页 |
| 2.4 漆酶酶活测定结果 | 第72-73页 |
| 2.5 胞内漆酶酶活测定结果 | 第73页 |
| 2.6 瓶栽试验结果 | 第73-77页 |
| 2.6.1 敲除菌株菌丝在栽培料中生长速度测定结果 | 第73-74页 |
| 2.6.2 不同时期栽培料漆酶酶活测定结果 | 第74-75页 |
| 2.6.3 不同菌株子实体形态观察及生理指标测定结果 | 第75-77页 |
| 3 小结与讨论 | 第77-79页 |
| 参考文献 | 第79-85页 |
| 附录1 松杉灵芝漆酶基因5'端及3'端非编码序列测序结果 | 第85-87页 |
| 致谢 | 第87页 |
