| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 第一章 绪论 | 第8-16页 |
| 1.1 有机磷农药的简介 | 第8-10页 |
| 1.1.1 有机磷农药的分类和化学结构 | 第8-9页 |
| 1.1.2 有机磷农药的毒性 | 第9页 |
| 1.1.3 有机磷农药的环境污染和残留问题 | 第9-10页 |
| 1.2 有机磷降解酶的研究概况 | 第10-12页 |
| 1.2.1 有机磷农药降解微生物的分离 | 第10页 |
| 1.2.2 有机磷水解酶的分类 | 第10-11页 |
| 1.2.3 有机磷水解酶的空间结构 | 第11页 |
| 1.2.4 有机磷水解酶的催化机制 | 第11-12页 |
| 1.3 甲基对硫磷水解酶的研究概况 | 第12-13页 |
| 1.3.1 甲基对硫磷水解酶来源与序列同源性 | 第12页 |
| 1.3.2 甲基对硫磷降解酶的结构 | 第12-13页 |
| 1.4 有机磷水解酶的分子改造研究 | 第13-14页 |
| 1.4.1 催化效率的改造 | 第13页 |
| 1.4.2 热稳定性的改造 | 第13-14页 |
| 1.4.3 拓展底物谱的改造 | 第14页 |
| 1.5 论文的立题依据和主要研究内容 | 第14-16页 |
| 1.5.1 立题依据 | 第14-15页 |
| 1.5.2 主要研究内容 | 第15-16页 |
| 第二章 材料与方法 | 第16-26页 |
| 2.1 实验菌株与质粒 | 第16页 |
| 2.2 实验设备与工具 | 第16-17页 |
| 2.2.1 仪器设备 | 第16-17页 |
| 2.2.2 实验试剂 | 第17页 |
| 2.3 培养基和实验溶液 | 第17-18页 |
| 2.4 分析软件及数据库网站 | 第18页 |
| 2.5 实验方法 | 第18-26页 |
| 2.5.1 重组质粒的提取 | 第18-19页 |
| 2.5.2 引物设计与mpd基因的PCR扩增 | 第19页 |
| 2.5.3 mpd基因片段和pET-28a载体的连接 | 第19-20页 |
| 2.5.4 大肠杆菌DH5α(JM109)和BL21(DE3)感受态的制备及转化 | 第20页 |
| 2.5.5 随机突变文库的构建 | 第20-21页 |
| 2.5.6 甲基对硫磷水解酶的定点突变及定点饱和突变 | 第21页 |
| 2.5.7 随机突变及定点饱和突变库的筛选 | 第21-22页 |
| 2.5.8 野生型及进化突变体的表达 | 第22-23页 |
| 2.5.9 野生型及进化突变体的分离纯化 | 第23页 |
| 2.5.10 SDS-PAGE检测 | 第23页 |
| 2.5.11 蛋白浓度的测定 | 第23页 |
| 2.5.12 甲基对硫磷水解酶酶活力的测定 | 第23-24页 |
| 2.5.13 甲基对硫磷水解酶动力学参数测定 | 第24页 |
| 2.5.14 甲基对硫磷水解酶野生型和突变体最适反应温度和热稳定性的测定 | 第24页 |
| 2.5.15 突变位点的生物信息学分析及突变体的结构建模 | 第24-26页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第26-54页 |
| 3.1 MPH在大肠杆菌中的异源表达及酶学性质测定 | 第26-33页 |
| 3.1.1 MPH在大肠杆菌中的诱导表达 | 第26页 |
| 3.1.2 MPH的分离纯化 | 第26-27页 |
| 3.1.3 MPH的酶学性质研究 | 第27-29页 |
| 3.1.4 最适反应pH及pH稳定性 | 第29-30页 |
| 3.1.5 MPH的酶活力及动力学参数测定 | 第30-32页 |
| 3.1.6 金属离子对甲基对硫磷水解酶活力的影响 | 第32页 |
| 3.1.7 有机溶剂对甲基对硫磷水解酶活力的影响 | 第32-33页 |
| 3.2 随机突变定向改造甲基对硫磷水解酶 | 第33-39页 |
| 3.2.1 易错PCR扩增mpd基因 | 第33页 |
| 3.2.2 易错突变库的构建 | 第33-34页 |
| 3.2.3 随机突变库的筛选 | 第34-35页 |
| 3.2.4 突变位点的结构分析 | 第35-37页 |
| 3.2.5 突变位点的生物信息学分析 | 第37-38页 |
| 3.2.6 突变体的圆二色谱分析 | 第38-39页 |
| 3.3 基于随机突变复合突变体的拆分及再组合 | 第39-44页 |
| 3.3.1 单点突变体,两位点突变体和三位点突变体的表达与蛋白纯化 | 第39-40页 |
| 3.3.2 单点突变体的酶学特征 | 第40-41页 |
| 3.3.3 双点突变体的酶学特征 | 第41-42页 |
| 3.3.4 三点突变体的酶学特征 | 第42-43页 |
| 3.3.5 关键位点的确认 | 第43-44页 |
| 3.4 关键氨基酸位点的改造及功能性分析 | 第44-49页 |
| 3.4.1 位点277饱和突变库的构建 | 第44-45页 |
| 3.4.2 位点277饱和突变库的筛选 | 第45页 |
| 3.4.3 最优正向突变体对乙基对硫磷的催化 | 第45-46页 |
| 3.4.4 最优突变体最适温度及热稳定性分析 | 第46-47页 |
| 3.4.5 最优突变体的圆二色谱分析 | 第47-48页 |
| 3.4.6 位点277相关loop构象的结构建模 | 第48-49页 |
| 3.5 活性口袋中心周围和通道处热点氨基酸的突变体的构建和功能研究 | 第49-54页 |
| 3.5.1 突变位点的选择 | 第49-50页 |
| 3.5.2 三个突变位点饱和突变库的构建及初筛 | 第50-51页 |
| 3.5.3 三个突变位点纯化及复筛 | 第51-52页 |
| 3.5.4 正向突变体最适温度及热稳定性分析 | 第52-54页 |
| 主要结论与展望 | 第54-55页 |
| 致谢 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-61页 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第61页 |
