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PRRSV强弱毒感染PAM细胞的差异膜蛋白分析及其作用机制的研究

摘要第6-8页
abstract第8-9页
英文缩略表第14-15页
第一章 引言第15-27页
    1.1 猪繁殖与呼吸综合征病概述第15页
    1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒概述第15-19页
        1.2.1 PRRSV基因组结构第15-16页
        1.2.2 PRRSV基因组复制与亚基因组转录第16-17页
        1.2.3 PRRSV编码的非结构蛋白与结构蛋白功能第17-18页
        1.2.4 PRRSV的细胞嗜性第18页
        1.2.5 PRRSV的细胞生命活动周期第18-19页
    1.3 PCSK9的研究进展第19-24页
        1.3.1 PCSK9的结构及功能特点第20页
        1.3.2 PCSK9的成熟过程第20-21页
        1.3.3 PCSK9的转录调节第21页
        1.3.4 PCSK9与胆固醇代谢的关系第21-22页
        1.3.5 PCSK9抑制剂的研究第22-23页
        1.3.6 PCSK9在细胞凋亡方面的研究第23-24页
        1.3.7 PCSK9在炎症免疫方面的研究第24页
        1.3.8 PCSK9在病毒方面的研究第24页
    1.4 胆固醇运输机制第24-26页
        1.4.1 胆固醇运输的载体—脂蛋白颗粒的简介第24-25页
        1.4.2 胆固醇的合成及代谢第25-26页
        1.4.3 HDL与LDL交换反应过程第26页
        1.4.4 LDL与LDLR结合释放胆固醇的机制第26页
    1.5 本研究的目的和意义第26-27页
第二章 PRRSV强弱毒差异膜蛋白的筛选及验证第27-38页
    2.1 材料与方法第27-29页
        2.1.1 病毒和细胞第27页
        2.1.2 主要试剂第27页
        2.1.3 主要仪器第27页
        2.1.4 肺泡巨噬细胞的分离和培养第27-28页
        2.1.5 PRRSV感染PAM第28页
        2.1.6 流式细胞术分选PAM第28页
        2.1.7 膜蛋白样品的制备第28页
        2.1.8 FASP酶解第28页
        2.1.9 LC-MSMS质谱分析第28-29页
        2.1.10 质谱数据分析第29页
        2.1.11 生物信息学分析第29页
    2.2 结果第29-35页
        2.2.1 PAM的病毒感染第29页
        2.2.2 Shotgun定性质谱分析结果第29-33页
        2.2.3 PAM差异膜蛋白对PRRSV复制的影响第33-35页
    2.3 讨论第35-38页
        2.3.1 HP-PRRSV强弱毒差异比较的意义第35页
        2.3.2 从膜蛋白方面探究PRRSV致病机制的可行性分析及意义第35-36页
        2.3.3 部分差异膜蛋白的筛选及功能分析第36页
        2.3.4 载脂蛋白与PRRSV细胞嗜性的关系的探讨第36页
        2.3.5 本研究中样品处理的优势之处第36-38页
第三章 PCSK9抑制PRRSV复制的作用阶段探究第38-50页
    3.1 材料与方法第38-43页
        3.1.1 病毒和细胞第38页
        3.1.2 主要抗体第38页
        3.1.3 主要酶和试剂第38页
        3.1.4 主要仪器设备第38页
        3.1.5 pCAGGS-PCSK9-Flag的构建第38-40页
        3.1.6 细胞内病毒RNA的提取第40-41页
        3.1.7 细胞上清中病毒RNA的提取第41页
        3.1.8 细胞内蛋白的提取第41页
        3.1.9 SDS-PAGE电泳及Westernblot第41-42页
        3.1.10 间接免疫荧光(IFA)第42页
        3.1.11 SYBR检测相关基因的mRNA表达水平第42-43页
    3.2 结果第43-47页
        3.2.1 pCAGGS-PCSK9的鉴定第43页
        3.2.2 PCSK9抑制北美型PRRSV强弱毒株的复制第43-44页
        3.2.3 PCSK9对强毒HuN4的抑制程度高于弱毒HuN4-F第44-45页
        3.2.4 PCSK9能抑制欧洲型PRRSV毒株的复制第45-46页
        3.2.5 PCSK9对病毒的吸附过程没有影响第46页
        3.2.6 PCSK9对病毒的进入过程没有影响第46-47页
        3.2.7 PCSK9对病毒的抑制作用发生在病毒进入后的阶段第47页
    3.3 讨论第47-50页
        3.3.1 PCSK9抑制PRRSV复制的结果分析第48页
        3.3.2 差异膜蛋白PCSK9很可能与强弱毒感染效率差异有关第48页
        3.3.3 PCSK9很可能通过影响细胞的胆固醇摄入过程影响PRRSV复制第48-50页
第四章 PCSK9抑制PRRSV复制机制的初步研究第50-61页
    4.1 材料与方法第50-51页
        4.1.1 病毒和细胞第50页
        4.1.2 主要试剂第50页
        4.1.3 主要仪器第50页
        4.1.4 免疫共沉淀(Co-IP)第50页
        4.1.5 激光共聚焦第50-51页
    4.2 结果第51-59页
        4.2.1 内源性PCSK9含量与病毒的感染剂量有关第51页
        4.2.2 内源性PCSK9含量与病毒的感染时间有关第51-52页
        4.2.3 PRRSV可通过泛素蛋白体途径降解PCSK第52-53页
        4.2.4 PCSK9对病毒的抑制作用与泛素蛋白酶体途径有关第53-54页
        4.2.5 PCSK9对PRRSV受体mRNA水平影响不显著第54-55页
        4.2.6 PCSK9不影响AnnexinA2含量的变化第55页
        4.2.7 PCSK9能够与LDLR互作第55-56页
        4.2.8 LDLR能抑制PRRSV复制第56页
        4.2.9 PCSK9可与PRRSV受体CD163互作第56-57页
        4.2.10 PCSK9可与PRRSV受体CD163共定位第57-58页
        4.2.11 PCSK9蛋白可通过泛素蛋白酶体途径降解CD163蛋白第58-59页
    4.3 讨论第59-61页
        4.3.1 PCSK9在PRRSV感染过程中的角色第59页
        4.3.2 PCSK9、AnnexinA2与PRRSV感染间关系的探讨第59页
        4.3.3 LDLR抑制PRRSV复制机制的探讨第59-60页
        4.3.4 PRRSV、PCSK9、CD163、泛素蛋白酶体间关系的探讨第60-61页
第五章 全文结论第61-62页
参考文献第62-71页
附录第71-73页
致谢第73-75页
作者简历第75页

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