| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 缩略词表 | 第9-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-30页 |
| 1.1 L-苯甘氨酸概述 | 第14页 |
| 1.2 L-苯甘氨酸化学合成方法简述 | 第14-15页 |
| 1.3 L-苯甘氨酸生物合成途径的设计 | 第15-17页 |
| 1.4 对羟基扁桃酸合酶 | 第17页 |
| 1.5 FMN 依赖的 -羟基酸氧化酶家族 | 第17-18页 |
| 1.6 磷酸吡哆醛依赖的氨基酸转氨酶 | 第18-19页 |
| 1.7 L-苯丙氨酸的生物合成及其调节 | 第19-25页 |
| 1.7.1 莽草酸合成途径及调节 | 第20-22页 |
| 1.7.2 L-苯丙氨酸专一途径 | 第22-23页 |
| 1.7.3 反馈阻遏调节蛋白 | 第23-25页 |
| 1.8 L-苯丙氨酸生产基座菌株的育种策略 | 第25-26页 |
| 1.8.1 莽草酸途径的代谢改造 | 第25-26页 |
| 1.8.2 L-苯丙氨酸专一途径的代谢改造 | 第26页 |
| 1.9 苯丙酮酸过量积累菌株的构建 | 第26-27页 |
| 1.10 葡萄糖吸收途径的育种策略 | 第27-28页 |
| 1.11 立题依据与主要研究内容 | 第28-30页 |
| 第二章 苯甘氨酸合成关键酶扁桃酸氧化酶的理性筛选 | 第30-44页 |
| 2.1 引言 | 第30页 |
| 2.2 材料与方法 | 第30-35页 |
| 2.2.1 主要仪器和试剂 | 第30-31页 |
| 2.2.2 分子生物学常规实验方法 | 第31-32页 |
| 2.2.3 菌株和质粒 | 第32页 |
| 2.2.4 引物 | 第32页 |
| 2.2.5 基于蛋白结构特征的理性筛选及表达纯化 | 第32-34页 |
| 2.2.6 亲和层析纯化 Hmo | 第34页 |
| 2.2.7 培养基和培养条件 | 第34-35页 |
| 2.2.8 扁桃酸及苯乙酮酸浓度和扁桃酸氧化酶活力测定方法 | 第35页 |
| 2.2.9 扁桃酸氧化酶的催化特性及动力学分析 | 第35页 |
| 2.2.10 扁桃酸氧化酶的三维结构模拟 | 第35页 |
| 2.3 结果与分析 | 第35-42页 |
| 2.3.1 基于结构的扁桃酸氧化酶筛选及基因簇分析 | 第35-37页 |
| 2.3.2 扁桃酸氧化酶三维结构特征 | 第37-38页 |
| 2.3.3 扁桃酸氧化酶的过量表达及验证 | 第38-40页 |
| 2.3.4 扁桃酸氧化酶的催化特性 | 第40-41页 |
| 2.3.5 扁桃酸氧化酶动力学分析 | 第41-42页 |
| 2.3.6 扁桃酸氧化酶热稳定性分析 | 第42页 |
| 2.4 本章小结 | 第42-44页 |
| 第三章 苯甘氨酸合成关键酶转氨酶的筛选 | 第44-54页 |
| 3.1 引言 | 第44页 |
| 3.2 材料与方法 | 第44-45页 |
| 3.2.1 主要试剂和仪器 | 第44页 |
| 3.2.2 分子生物学实验方法 | 第44页 |
| 3.2.3 菌株和质粒 | 第44页 |
| 3.2.4 引物 | 第44-45页 |
| 3.2.5 分子对接及表达纯化 | 第45页 |
| 3.2.6 苯甘氨酸浓度及苯甘氨酸转氨酶活力测定方法 | 第45页 |
| 3.2.7 苯甘氨酸转氨酶的催化特性及动力学分析 | 第45页 |
| 3.3 结果与分析 | 第45-53页 |
| 3.3.1 L-苯甘氨酸转氨酶的过量表达及分离纯化 | 第45-47页 |
| 3.3.2 L-苯甘氨酸转氨酶与氨基供体的分子对接 | 第47-48页 |
| 3.3.3 L-苯甘氨酸转氨酶氨基供体确认 | 第48页 |
| 3.3.4 L-苯甘氨酸转氨酶产物构型确认 | 第48-49页 |
| 3.3.5 L-苯甘氨酸转氨酶的动力学分析 | 第49-50页 |
| 3.3.6 L-苯甘氨酸转氨酶的氨基供体谱 | 第50页 |
| 3.3.7 L-苯甘氨酸转氨酶的催化特性 | 第50-51页 |
| 3.3.8 L-苯甘氨酸转氨酶的稳定性 | 第51-52页 |
| 3.3.9 L-苯甘氨酸生物合成途径 | 第52-53页 |
| 3.4 本章小结 | 第53-54页 |
| 第四章 AroG 和 PheA 的高效率热稳定突变体筛选 | 第54-75页 |
| 4.1 引言 | 第54页 |
| 4.2 材料与方法 | 第54-62页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第54-55页 |
| 4.2.2 引物 | 第55-57页 |
| 4.2.3 基因扩增条件 | 第57页 |
| 4.2.4 培养基 | 第57页 |
| 4.2.5 表达载体构建方法 | 第57-60页 |
| 4.2.6 荧光定量 PCR 测定表达水平 | 第60页 |
| 4.2.7 抗代谢类似物生长能力测定 | 第60页 |
| 4.2.8 摇瓶发酵及分批补料发酵 | 第60页 |
| 4.2.9 发酵诱导及细胞破碎 | 第60-61页 |
| 4.2.10 圆二色谱热敏性（Tm 值）分析 | 第61页 |
| 4.2.11 发酵过程的测定方法 | 第61-62页 |
| 4.3 结果与分析 | 第62-73页 |
| 4.3.1 蛋白 PheA~(fbr)反馈抑制的解除 | 第62页 |
| 4.3.2 基因 pheA~(fbr)过表达验证 | 第62-65页 |
| 4.3.3 基因 pheA~(fbr)抗反馈抑制功能验证 | 第65页 |
| 4.3.4 蛋白 PheA~(fbr)催化特性 | 第65-66页 |
| 4.3.5 基因 pheA~(fbr)的发酵性能 | 第66页 |
| 4.3.6 蛋白 AroG 反馈抑制的解除 | 第66-68页 |
| 4.3.7 突变体 AroG 积累 L-苯丙氨酸性能 | 第68-69页 |
| 4.3.8 突变体 AroG 的热稳定性 | 第69-71页 |
| 4.3.9 突变基因 aroG15 的组成型表达 | 第71-72页 |
| 4.3.10 基因 ydiB 和 aroK 的过量表达及发酵特性 | 第72-73页 |
| 4.4 本章小结 | 第73-75页 |
| 第五章 系统代谢水平构建 L-苯丙氨酸基座菌株 | 第75-97页 |
| 5.1 引言 | 第75-77页 |
| 5.2 材料与方法 | 第77-84页 |
| 5.2.1 主要试剂和仪器 | 第77页 |
| 5.2.2 分子生物学实验方法 | 第77页 |
| 5.2.3 菌株和质粒 | 第77-78页 |
| 5.2.4 引物 | 第78页 |
| 5.2.5 基因敲除方法 | 第78-80页 |
| 5.2.6 培养基和培养条件 | 第80页 |
| 5.2.7 基因 tyrB 反馈阻遏的解除 | 第80-81页 |
| 5.2.8 温度开关表达载体构建方法 | 第81-83页 |
| 5.2.9 胞内 L-苯丙氨酸浓度测定方法 | 第83-84页 |
| 5.2.10 温敏启动子表达水平测定方法 | 第84页 |
| 5.3 结果与分析 | 第84-95页 |
| 5.3.1 基因 pheAfbr和 aroG15 的温控表达 | 第84-86页 |
| 5.3.2 基因 ydiB 和 aroK 的温控表达 | 第86-87页 |
| 5.3.3 葡萄糖吸收系统改造对菌株生长的影响 | 第87-89页 |
| 5.3.4 葡萄糖吸收系统及酪氨酸缺陷对 L-苯丙氨酸发酵的影响 | 第89-90页 |
| 5.3.5 增强 L-苯丙氨酸转氨酶及胞外运输 | 第90-91页 |
| 5.3.6 基因 tyrB 和 yddG 的表达水平 | 第91-92页 |
| 5.3.7 过表达 yddG 对胞内及胞外 L-苯丙氨酸浓度影响 | 第92-93页 |
| 5.3.8 质粒 pR15ABK 与 pR15BABKG 分批补料发酵过程比较 | 第93-95页 |
| 5.4 本章小结 | 第95-97页 |
| 第六章 延伸基座菌株代谢途径合成 L-苯甘氨酸 | 第97-112页 |
| 6.1 引言 | 第97页 |
| 6.2 材料与方法 | 第97-104页 |
| 6.2.1 主要试剂和仪器 | 第97页 |
| 6.2.2 分子生物学实验方法 | 第97页 |
| 6.2.3 菌株和质粒 | 第97-98页 |
| 6.2.4 引物 | 第98-100页 |
| 6.2.5 培养基和培养条件 | 第100页 |
| 6.2.6 苯丙酮酸合成基座的构建方法 | 第100-101页 |
| 6.2.7 苯甘氨酸合成基因簇构建方法 | 第101-103页 |
| 6.2.8 苯甘氨酸合成载体的构建方法 | 第103-104页 |
| 6.2.9 酶活测定方法 | 第104页 |
| 6.2.10 浓度测定方法 | 第104页 |
| 6.3 结果与分析 | 第104-111页 |
| 6.3.1 温控表达质粒的构建 | 第104-105页 |
| 6.3.2 L-苯甘氨酸合成基因簇的构建 | 第105-106页 |
| 6.3.3 L-苯甘氨酸在大肠杆菌中的代谢合成 | 第106页 |
| 6.3.4 L-苯丙氨酸基座菌株中转氨酶活力弱化 | 第106-108页 |
| 6.3.5 L-苯丙氨酸转氨酶基因缺失菌株的生长特性 | 第108-109页 |
| 6.3.6 L-苯丙氨酸转氨酶基因缺失对 L-苯甘氨酸合成的影响 | 第109-110页 |
| 6.3.7 L-苯甘氨酸生物合成途径中的限制性步骤 | 第110页 |
| 6.3.8 扁桃酸合酶表达量对 L-苯甘氨酸合成的影响 | 第110-111页 |
| 6.4 本章小结 | 第111-112页 |
| 论文结论与展望 | 第112-117页 |
| 论文创新点 | 第117-118页 |
| 致谢 | 第118-119页 |
| 参考文献 | 第119-126页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第126页 |
