| 摘要 | 第3-5页 |
| abstract | 第5-7页 |
| 缩略词及中英文对照 | 第8-15页 |
| 1 前言 | 第15-28页 |
| 1.1 香蕉枯萎病概况 | 第15-18页 |
| 1.1.1 香蕉枯萎病的发生与危害情况 | 第15-16页 |
| 1.1.2 香蕉枯萎病菌的生理小种 | 第16页 |
| 1.1.3 香蕉枯萎病的防治 | 第16-18页 |
| 1.1.3.1 化学防治 | 第16-17页 |
| 1.1.3.2 生物防治 | 第17-18页 |
| 1.1.3.3 抗病育种 | 第18页 |
| 1.2 尖孢镰刀菌致病相关基因研究 | 第18-22页 |
| 1.2.1 G蛋白 | 第19-20页 |
| 1.2.2 转录因子 | 第20-21页 |
| 1.2.3 效应子 | 第21页 |
| 1.2.4 几丁质合成酶 | 第21-22页 |
| 1.3 MADS-Box转录因子研究慨况 | 第22-24页 |
| 1.3.1 MADS-Box功能介绍 | 第22-23页 |
| 1.3.2 MADS-Box在真菌中的研究现状 | 第23-24页 |
| 1.4 PA14基因家族 | 第24-27页 |
| 1.5 研究目的和意义 | 第27-28页 |
| 2 材料与方法 | 第28-59页 |
| 2.1 主要仪器和设备 | 第28页 |
| 2.2 主要试剂 | 第28-29页 |
| 2.3 供试菌株 | 第29页 |
| 2.4 供试植物 | 第29页 |
| 2.5 宿主菌 | 第29页 |
| 2.6 质粒载体 | 第29-30页 |
| 2.7 主要培养基和溶液的配制 | 第30-32页 |
| 2.8 试验方法 | 第32-59页 |
| 2.8.1 致病相关基因的实时荧光定量检测及筛选 | 第32-35页 |
| 2.8.1.1 Foc1和Foc4经香蕉根部处理 | 第32页 |
| 2.8.1.2 Foc及香蕉根部总RNA提取 | 第32-33页 |
| 2.8.1.3 c DNA第一链的合成 | 第33-34页 |
| 2.8.1.4 Real-time PCR引物设计 | 第34页 |
| 2.8.1.5 Real-time PCR反应 | 第34-35页 |
| 2.8.2 香蕉枯萎病菌Mads1，Flo1基因的克隆 | 第35-44页 |
| 2.8.2.1 香蕉枯萎病菌基因组DNA的提取 | 第35-36页 |
| 2.8.2.2 香蕉枯萎病菌RNA提取 | 第36-37页 |
| 2.8.2.3 引物设计 | 第37-38页 |
| 2.8.2.4 香蕉枯萎病菌Mads1、Flo1基因DNA的扩增 | 第38-39页 |
| 2.8.2.5 香蕉枯萎病菌Mads1、Flo1基因c DNA的扩增 | 第39-40页 |
| 2.8.2.6 PCR产物的回收 | 第40-41页 |
| 2.8.2.7 宿主菌E.coli DH5α 感受态细胞的制备 | 第41页 |
| 2.8.2.8 回收产物的连接转化、蓝白斑筛选转化子 | 第41-42页 |
| 2.8.2.9 单菌落PCR筛选阳性克隆 | 第42页 |
| 2.8.2.10 阳性克隆质粒的抽提及测序 | 第42-43页 |
| 2.8.2.11 序列分析与对比 | 第43-44页 |
| 2.8.3 Mads1、Flo1侧翼片段hi TAIL-PCR扩增 | 第44-47页 |
| 2.8.3.1 Mads1、Flo1侧翼片段hi TAIL-PCR扩增引物设计及反应体系 | 第44-46页 |
| 2.8.3.2 PCR产物的回收 | 第46页 |
| 2.8.3.3 回收产物的连接转化与转化 | 第46页 |
| 2.8.3.4 阳性克隆的筛选与鉴定 | 第46页 |
| 2.8.3.5 阳性克隆质粒的抽提及测序 | 第46-47页 |
| 2.8.4 香蕉枯萎病菌Mads1、Flo1致病功能验证 | 第47-59页 |
| 2.8.4.1 基因敲除引物的设计 | 第47页 |
| 2.8.4.2 敲除载体构建策略 | 第47-48页 |
| 2.8.4.3 Mads1、Flo1上游基因敲除片段的构建 | 第48-49页 |
| 2.8.4.4 Mads1、Flo1下游基因敲除片段的构建 | 第49页 |
| 2.8.4.5 Mads1、Flo1上游同源臂与载体p BHt2相连 | 第49-50页 |
| 2.8.4.6 Mads1、Flo1下游同源臂与载体p BHt2相连 | 第50-52页 |
| 2.8.4.7 根癌农杆菌感受态细胞的制备 | 第52页 |
| 2.8.4.8 敲除载体质粒电击转化根癌农杆菌 | 第52-53页 |
| 2.8.4.9 ATMT介导转化 | 第53页 |
| 2.8.4.10 Mads1、Flo1基因敲除突变体的筛选鉴定 | 第53-54页 |
| 2.8.4.11 Southern杂交鉴定 | 第54-57页 |
| 2.8.4.12 敲除突变体菌落形态观察和生长速率测定 | 第57页 |
| 2.8.4.13 突变体的产孢量比较 | 第57页 |
| 2.8.4.14 Mads1、Flo1基因敲除突变体的致病性测定 | 第57-59页 |
| 3 结果与分析 | 第59-99页 |
| 3.1 致病相关基因的表达量分析 | 第59-65页 |
| 3.1.1 香蕉枯萎病菌及香蕉根部总RNA提取 | 第59页 |
| 3.1.2 致病相关基因在Foc处理香蕉根部后的表达量变化 | 第59-65页 |
| 3.1.3 实时荧光定量结果小结 | 第65页 |
| 3.2 香蕉枯萎病菌总DNA和总RNA的提取 | 第65-66页 |
| 3.2.1 香蕉枯萎病菌1号和4号小种总DNA的提取 | 第65-66页 |
| 3.2.2 香蕉枯萎病菌1号和4号小种RNA的提取 | 第66页 |
| 3.3 香蕉枯萎病菌Mads1、Flo1基因的克隆和序列分析 | 第66-76页 |
| 3.3.1 Mads1、Flo1基因DNA的扩增与克隆 | 第66-67页 |
| 3.3.2 Mads1、Flo1基因c DNA的扩增与克隆 | 第67-68页 |
| 3.3.3 Mads1、Flo1基因c DNA与DNA的序列分析 | 第68页 |
| 3.3.4 Mads1、Flo1基因2小种的核苷酸及氨基酸的比较 | 第68-71页 |
| 3.3.5 Mads1、Flo1蛋白功能域预测分析 | 第71-72页 |
| 3.3.6 Mads1、Flo1编码蛋白二级结构预测分析 | 第72-74页 |
| 3.3.7 Mads1、Flo1编码蛋白三级结构预测分析 | 第74页 |
| 3.3.8 Mads1、Flo1氨基酸序列遗传发育树构建 | 第74-76页 |
| 3.4 Mads1、Flo1基因侧翼序列的扩增和克隆 | 第76-78页 |
| 3.4.1 hi TAIL-PCR扩增Mads1、Flo1上游序列 | 第76-77页 |
| 3.4.2 hi TAIL-PCR扩增Mads1、Flo1下游序列 | 第77-78页 |
| 3.5 香蕉枯萎病菌Mads1、Flo1基因的敲除 | 第78-99页 |
| 3.5.1 Mads1、Flo1基因上下游同源臂扩增 | 第78-80页 |
| 3.5.2 Mads1、Flo1基因的敲除载体构建 | 第80-86页 |
| 3.5.2.1 Mads1、Flo1基因上游同源臂与敲除载体p BHt2连接 | 第80-83页 |
| 3.5.2.2 Mads1、Flo1基因下游同源臂与p BHt2-Mads1-up、p BHt2-Flo1-up连接 | 第83-86页 |
| 3.5.3 重组敲除质粒转化根癌农杆菌AGL1的结果 | 第86-88页 |
| 3.5.3.1 重组敲除质粒p BHT2-△Mads1转化根癌农杆菌AGL1的结果 | 第86-87页 |
| 3.5.3.2 重组敲除质粒p BHT2-△Flo1转化根癌农杆菌AGL1的结果 | 第87-88页 |
| 3.5.4 Mads1、Flo1基因敲除突变体的PCR检测 | 第88-91页 |
| 3.5.4.1 Mads1基因敲除突变体的PCR检测 | 第88-90页 |
| 3.5.4.2 Flo1基因敲除突变体的PCR检测 | 第90-91页 |
| 3.5.5 Mads1、Flo1敲除突变体的Southern Blot检测 | 第91-92页 |
| 3.5.6 Mads1、Flo1基因敲除突变体的生物学特性 | 第92-96页 |
| 3.5.6.1 Mads1、Flo1基因敲除突变体的表型 | 第92-93页 |
| 3.5.6.2 Mads1、Flo1基因敲除突变体产孢量比较 | 第93-95页 |
| 3.5.6.3 Mads1、Flo1基因敲除突变体生长速率比较 | 第95-96页 |
| 3.5.7 Mads1、Flo1基因敲除突变体的致病性测定 | 第96-99页 |
| 4 结论与讨论 | 第99-105页 |
| 4.1 致病相关基因实时荧光定量验证 | 第99页 |
| 4.2 Mads1、Flo1基因克隆和序列分析 | 第99-102页 |
| 4.3 Mads1、Flo1基因的致病功能验证 | 第102-104页 |
| 4.4 展望 | 第104-105页 |
| 致谢 | 第105-106页 |
| 参考文献 | 第106-117页 |
| 附录 | 第117-119页 |
