| 摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9页 |
| 1 前言 | 第10-20页 |
| 1.1 南方水稻黑条矮缩病毒的研究情况 | 第10-15页 |
| 1.1.1 症状特征及病害流行情况 | 第10-11页 |
| 1.1.2 传播介体及寄主范围 | 第11页 |
| 1.1.3 病害发生的原因分析 | 第11-12页 |
| 1.1.4 防治措施 | 第12页 |
| 1.1.5 病毒粒体形态及分类地位 | 第12-13页 |
| 1.1.6 基因组及蛋白功能的研究 | 第13-15页 |
| 1.2 水稻原生质体系研究情况 | 第15-16页 |
| 1.3 免疫荧光技术 | 第16页 |
| 1.4 实时定量PCR技术 | 第16-18页 |
| 1.4.1 qPCR的原理 | 第16-17页 |
| 1.4.2 qPCR的种类 | 第17页 |
| 1.4.3 qPCR的定量方法 | 第17-18页 |
| 1.4.4 qPCR技术的应用前景 | 第18页 |
| 1.5 本研究的目的及意义 | 第18-20页 |
| 2 SRBSDV P9-1和P10蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 | 第20-35页 |
| 2.1 材料 | 第20-21页 |
| 2.1.1 SRBSDV水稻毒株与白背飞虱 | 第20页 |
| 2.1.2 载体和菌株 | 第20页 |
| 2.1.3 实验室试剂 | 第20-21页 |
| 2.2 方法 | 第21-29页 |
| 2.2.1 原核表达引物的设计 | 第21页 |
| 2.2.2 植物总RNA的提取 | 第21-22页 |
| 2.2.3 RT-PCR | 第22-23页 |
| 2.2.3.1 RT | 第22页 |
| 2.2.3.2 PCR | 第22-23页 |
| 2.2.4 回收PCR产物 | 第23-24页 |
| 2.2.5 Gateway入门载体构建 | 第24页 |
| 2.2.6 热激法转化大肠杆菌 | 第24页 |
| 2.2.7 菌落PCR鉴定 | 第24-25页 |
| 2.2.8 提取质粒获得pDONR221-P9-1、pDONR221-P10载体 | 第25-26页 |
| 2.2.9 LR反应获得表达载体pDEST17-P9-1、pDEST17-P10 | 第26页 |
| 2.2.10 Rosetta感受态细胞的制备 | 第26页 |
| 2.2.11 SRBSDV P9-1、P10蛋白的原核表达 | 第26-27页 |
| 2.2.12 SRBSDV P9-1、P10重组蛋白的多抗血清的制备 | 第27页 |
| 2.2.13 植物总蛋白的提取 | 第27-28页 |
| 2.2.14 Western blot检测抗体的特异性 | 第28页 |
| 2.2.15 间接ELISA法测抗体效价 | 第28页 |
| 2.2.16 免疫捕获PCR(IC-RT-PCR)检测SRBSDV | 第28-29页 |
| 2.2.17 Dot-blot ELISA检测白背飞風内及水稻植株上的SRBSDV | 第29页 |
| 2.3 结果与分析 | 第29-34页 |
| 2.3.1 原核表达载体pDEST17-P9-1、pDEST17-P10载体的构建 | 第29-30页 |
| 2.3.2 P9-1、P10蛋白的原核表达分析 | 第30页 |
| 2.3.3 Western blot检测P9-1、P10抗体特异性 | 第30-31页 |
| 2.3.4 P9-1、P10抗体效价检测 | 第31-32页 |
| 2.3.5 P9-1、P10抗体IC-RT-PCR检测SRBSDV | 第32页 |
| 2.3.6 Dot-blot ELISA检测水稻和白背飞虱中的SRBSDV | 第32-34页 |
| 2.4 小结与讨论 | 第34-35页 |
| 3 SRBSDV在水稻原生质体内的复制和表达 | 第35-56页 |
| 3.1 材料 | 第35-36页 |
| 3.1.1 植物材料 | 第35页 |
| 3.1.2 载体、菌种及抗体 | 第35页 |
| 3.1.3 试剂和仪器 | 第35-36页 |
| 3.2 方法 | 第36-42页 |
| 3.2.1 酶解得到原生质体 | 第36页 |
| 3.2.2 血球计数板计算得率 | 第36-37页 |
| 3.2.3 FDA检测原生质体的活性 | 第37页 |
| 3.2.4 提纯抗体IgG | 第37-38页 |
| 3.2.5 荧光抗体的交联 | 第38页 |
| 3.2.6 SRBSDV粗侵染液的制备 | 第38页 |
| 3.2.7 SRBSDV侵染原生质体 | 第38-39页 |
| 3.2.8 免疫荧光检测SRBSDV在水稻原生质体内的复制情况 | 第39页 |
| 3.2.9 real-time PCR检测SRBSDV在水稻原生质体内的复制情况 | 第39-42页 |
| 3.2.9.1 感病植物总RNA的提取 | 第39页 |
| 3.2.9.2 消化基因组DNA | 第39页 |
| 3.2.9.3 RNA的纯化 | 第39-40页 |
| 3.2.9.4 RT-PCR | 第40页 |
| 3.2.9.5 荧光定量PCR引物的设计 | 第40页 |
| 3.2.9.6 荧光定量PCR引物的筛选 | 第40-41页 |
| 3.2.9.7 标准曲线的建立 | 第41-42页 |
| 3.2.9.8 qPCR检测SRBSDV相关基因在水稻原生质体内表达量 | 第42页 |
| 3.2.10 Western blot检测SRBSDV在水稻原生质体内的复制情况 | 第42页 |
| 3.3 结果与分析 | 第42-54页 |
| 3.3.1 原生质体的获得率 | 第42页 |
| 3.3.2 原生质体的活性测定 | 第42-43页 |
| 3.3.3 共聚焦显微镜下观察病毒在水稻原生质体内的复制 | 第43-44页 |
| 3.3.4 SRBSDV复制相关基因在水稻原生质体后132h内动态变化 | 第44-52页 |
| 3.3.4.1 标准质粒溶解曲线 | 第44-46页 |
| 3.3.4.2 标准质粒的标准曲线的制作(图3-12至图3-19) | 第46-49页 |
| 3.3.4.3 SRBSDV基因在水稻原生质体内的转录动态 | 第49-52页 |
| 3.3.5 SRBSDV基因在侵染水稻原生质体后132h内表达动态 | 第52-54页 |
| 3.4 小结与讨论 | 第54-56页 |
| 全文小结与展望 | 第56-58页 |
| 参考文献 | 第58-64页 |
| 附录 | 第64-72页 |
| 附录一 SRBSDV荧光定量PCR引物 | 第64-65页 |
| 附录二 主要试剂与溶液的配制 | 第65-70页 |
| 附录三 本文所用的植物表达载体 | 第70-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
