| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 项目资金来源 | 第7-8页 |
| 缩略词中英文对照表 | 第8-13页 |
| 第1章 文献综述 | 第13-22页 |
| 1.1 研究背景 | 第13-22页 |
| 1.1.1 白细胞介素的命名及应用前景 | 第13页 |
| 1.1.2 IL-7的发现、结构及来源 | 第13-14页 |
| 1.1.2.1 IL-7的发现 | 第13-14页 |
| 1.1.2.2 IL-7的结构 | 第14页 |
| 1.1.2.3 IL-7的来源 | 第14页 |
| 1.1.3 IL-7的生物活性 | 第14-15页 |
| 1.1.4 IL-7的应用前景 | 第15-18页 |
| 1.1.4.1 IL-7与人类免疫缺陷病毒(HIV) | 第15页 |
| 1.1.4.2 IL-7与肿瘤 | 第15-16页 |
| 1.1.4.3 IL-7与类风湿关节炎 | 第16页 |
| 1.1.4.4 IL-7与结核病 | 第16-17页 |
| 1.1.4.5 IL-7与白血病 | 第17页 |
| 1.1.4.6 IL-7与急性冠脉综合征冠心病 | 第17页 |
| 1.1.4.7 IL-7与同种基因骨髓移植 | 第17-18页 |
| 1.1.4.8 IL-7与肺纤维化 | 第18页 |
| 1.1.5 IL-7蛋白表达研究的几种方法 | 第18-22页 |
| 1.1.5.1 大肠杆菌表达系统表达IL-7 | 第18-19页 |
| 1.1.5.2 毕赤酵母表达系统表达IL-7 | 第19页 |
| 1.1.5.3 昆虫表达系统表达IL-7 | 第19-20页 |
| 1.1.5.4 哺乳动物表达系统表达IL-7 | 第20-22页 |
| 第2章 IL-7慢病毒表达载体的构建及稳定表达 | 第22-41页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-25页 |
| 2.1.1 细胞、菌株及质粒 | 第22页 |
| 2.1.2 主要实验试剂 | 第22-23页 |
| 2.1.3 仪器设备 | 第23页 |
| 2.1.4 主要溶液配制 | 第23-25页 |
| 2.2 试验方法 | 第25-36页 |
| 2.2.1 获取目的基因 | 第25-26页 |
| 2.2.2 慢病毒表达载体的构建 | 第26-29页 |
| 2.2.2.1 设计引物 | 第26页 |
| 2.2.2.2 引物配制 | 第26页 |
| 2.2.2.3 IL-7基因PCR扩增 | 第26-27页 |
| 2.2.2.4 IL-7扩增片段与pLV-CMV-EF1-GP载体的酶切及胶回收 | 第27-28页 |
| 2.2.2.5 IL-7与pLV-CMV-EF1-GP载体连接 | 第28页 |
| 2.2.2.6 转化感受态细胞 | 第28-29页 |
| 2.2.2.7 单克隆 | 第29页 |
| 2.2.2.8 重组质粒pLV-CMV-EF1-GP-IL7的提取 | 第29页 |
| 2.2.2.9 重组质粒pLV-CMV-EF1-GP-IL7的鉴定 | 第29页 |
| 2.2.3 慢病毒包装 | 第29-31页 |
| 2.2.3.1 细胞准备 | 第29-30页 |
| 2.2.3.2 慢病毒包装 | 第30页 |
| 2.2.3.3 病毒的浓缩 | 第30页 |
| 2.2.3.4 慢病毒的滴度的测定 | 第30-31页 |
| 2.2.4 CHO-K1与HEK293细胞凝聚胺与嘌呤霉素最小致死浓度筛选 | 第31页 |
| 2.2.4.1 CHO-K1与HEK293细胞复苏及传代 | 第31页 |
| 2.2.4.2 凝聚胺与嘌呤霉素最小致死浓度筛选 | 第31页 |
| 2.2.5 慢病毒感染实验 | 第31-32页 |
| 2.2.5.1 慢病毒的使用 | 第31页 |
| 2.2.5.2 慢病毒感染CHO-K1与HEK293细胞预实验 | 第31-32页 |
| 2.2.5.3 慢病毒感染CHO-K1与HEK293细胞正式实验 | 第32页 |
| 2.2.6 慢病毒感染细胞的绿色荧光表达情况 | 第32页 |
| 2.2.7 IL-7基因的转录表达 | 第32-34页 |
| 2.2.7.1 总RNA提取 | 第32-33页 |
| 2.2.7.2 两步法反转录 | 第33页 |
| 2.2.7.3 IL-7基因PCR扩增及检测 | 第33-34页 |
| 2.2.8 IL-7的ELISA检测 | 第34-35页 |
| 2.2.8.1 标准品稀释 | 第34页 |
| 2.2.8.2 检测方法 | 第34-35页 |
| 2.2.9 SDS-PAGE电泳 | 第35页 |
| 2.2.10 Western-blot分析 | 第35页 |
| 2.2.11 细胞的冻存 | 第35页 |
| 2.2.12 冻存细胞的复苏 | 第35-36页 |
| 2.2.12.1 细胞复苏 | 第35-36页 |
| 2.2.12.2 细胞形态观察 | 第36页 |
| 2.3 试验结果 | 第36-40页 |
| 2.3.1 慢病毒载体构建 | 第36页 |
| 2.3.2 慢病毒的包装以及其滴度检测 | 第36-37页 |
| 2.3.3 凝聚胺与嘌呤霉素最小致死浓度筛选 | 第37页 |
| 2.3.4 基因重组IL-7慢病毒感染CHO-K1与HEK293细胞 | 第37-38页 |
| 2.3.5 IL-7基因的转录表达检测 | 第38-39页 |
| 2.3.6 ELISA检测分析 | 第39页 |
| 2.3.7 Western-blot分析 | 第39-40页 |
| 2.3.8 冻存细胞的复苏 | 第40页 |
| 2.3.8.1 细胞复苏 | 第40页 |
| 2.3.8.2 细胞形态观察 | 第40页 |
| 2.4 小结 | 第40-41页 |
| 第3章 IL-7真核表达载体的构建及稳定表达 | 第41-57页 |
| 3.1 实验材料 | 第41页 |
| 3.1.1 细胞、菌株及质粒 | 第41页 |
| 3.1.2 主要实验试剂 | 第41页 |
| 3.1.3 仪器设备 | 第41页 |
| 3.1.4 主要溶液配制 | 第41页 |
| 3.2 试验方法 | 第41-51页 |
| 3.2.1 设计引物及合成 | 第41-42页 |
| 3.2.2 IL-7基因扩增 | 第42页 |
| 3.2.2.1 引物配制 | 第42页 |
| 3.2.2.2 IL-7基因的扩增 | 第42页 |
| 3.2.3 构建重组表达载体pcDNA3.1-IL7 | 第42-45页 |
| 3.2.3.1 双酶切及胶回收 | 第42-43页 |
| 3.2.3.2 IL-7基因与pcDNA3.1载体连接 | 第43页 |
| 3.2.3.3 转化感受态细胞BL21 | 第43-44页 |
| 3.2.3.4 单克隆 | 第44页 |
| 3.2.3.5 重组质粒pcDNA3.1-IL7的提取 | 第44页 |
| 3.2.3.6 菌液PCR鉴定 | 第44-45页 |
| 3.2.3.7 质粒酶切验证 | 第45页 |
| 3.2.3.8 测序鉴定 | 第45页 |
| 3.2.3.9 重组菌液pcDNA3.1-IL7的保存 | 第45页 |
| 3.2.4 细胞G418最小致死浓度的筛选 | 第45页 |
| 3.2.5 转染CHO-K1与HEK293细胞 | 第45-46页 |
| 3.2.5.1 铺板 | 第45页 |
| 3.2.5.2 转染 | 第45-46页 |
| 3.2.5.3 转染细胞的G418筛选 | 第46页 |
| 3.2.5.4 细胞观察 | 第46页 |
| 3.2.6 CHO-K1-IL7与HEK293细胞克隆 | 第46页 |
| 3.2.7 克隆细胞的初检及其保存 | 第46-47页 |
| 3.2.7.1 IL-7的ELISA检测 | 第46-47页 |
| 3.2.7.2 克隆细胞保存 | 第47页 |
| 3.2.8 克隆细胞株的IL-7基因转录表达 | 第47-49页 |
| 3.2.8.1 总RNA提取 | 第47-48页 |
| 3.2.8.2 两步法反转录 | 第48页 |
| 3.2.8.3 IL-7基因PCR扩增及检测 | 第48-49页 |
| 3.2.9 克隆细胞株IL-7的ELISA检测 | 第49-50页 |
| 3.2.9.1 标准品稀释 | 第49页 |
| 3.2.9.2 检测方法 | 第49-50页 |
| 3.2.10 SDS-PAGE电泳 | 第50页 |
| 3.2.11 Western-blot分析 | 第50页 |
| 3.2.12 克隆细胞株冻存 | 第50-51页 |
| 3.2.13 冻存细胞的复苏 | 第51页 |
| 3.2.13.1 细胞复苏 | 第51页 |
| 3.2.13.2 细胞形态观察 | 第51页 |
| 3.3 试验结果 | 第51-56页 |
| 3.3.1 构建重组表达载体pcDNA3.1-IL7 | 第51-52页 |
| 3.3.2 细胞G418最小致死浓度的筛选 | 第52页 |
| 3.3.3 转染细胞观察 | 第52-53页 |
| 3.3.4 CHO-K1-IL7与HEK293-IL7细胞克隆及IL-7蛋白初检 | 第53-54页 |
| 3.3.5 克隆细胞株IL-7基因的转录表达检测 | 第54-55页 |
| 3.3.6 克隆细胞株IL-7的ELISA检测 | 第55页 |
| 3.3.7 Western-blot分析 | 第55-56页 |
| 3.3.8 冻存细胞的复苏 | 第56页 |
| 3.3.8.1 细胞复苏 | 第56页 |
| 3.3.8.2 细胞形态观察 | 第56页 |
| 3.4 小结 | 第56-57页 |
| 第4章 结论 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-63页 |
| 附录 | 第63-64页 |
| 1. 作者简介 | 第63页 |
| 2. 攻读硕士学位期间的研究成果 | 第63页 |
| 3. 硕士期间参与的课题研究 | 第63-64页 |
| 致谢 | 第64页 |
