| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一部分：文献综述 | 第11-19页 |
| 1 病毒载体表达系统 | 第11-15页 |
| 1.1 腺病毒载体系统 | 第11-12页 |
| 1.2 腺相关病毒载体系统 | 第12-13页 |
| 1.3 逆转录病毒载体系统 | 第13-14页 |
| 1.4 慢病毒载体系统 | 第14-15页 |
| 2 定点整合位点特异性重组酶系统 | 第15-16页 |
| 3 siat7e基因概述 | 第16-19页 |
| 第二部分：试验研究 | 第19-58页 |
| 第一章 Flp-In MDCK细胞构建 | 第19-38页 |
| 1 材料及仪器设备 | 第20-21页 |
| 1.1 材料及试剂 | 第20-21页 |
| 1.2 仪器设备 | 第21页 |
| 2 实验步骤及方法 | 第21-32页 |
| 2.1 重组慢病毒表达质粒pLVX-FRT-LacZ-PGK-Puro的构建 | 第21-27页 |
| 2.1.1 引物设计 | 第21-22页 |
| 2.1.2 FRT-LacZ基因扩增 | 第22页 |
| 2.1.3 FRT-LacZ基因PCR产物纯化 | 第22-23页 |
| 2.1.4 FRT-LacZ基因片段与载体双酶切 | 第23页 |
| 2.1.5 DNA片段回收 | 第23-24页 |
| 2.1.6 连接反应 | 第24页 |
| 2.1.7 重组质粒转化与阳性克隆筛选 | 第24-25页 |
| 2.1.8 重组质粒提取 | 第25页 |
| 2.1.9 重组质粒酶切鉴定 | 第25页 |
| 2.1.10 测序鉴定 | 第25-26页 |
| 2.1.11 重组质粒大量制备 | 第26-27页 |
| 2.2 重组慢病毒的包装 | 第27-28页 |
| 2.3 病毒滴度测定 | 第28-29页 |
| 2.4 确定MDCK细胞嘌呤霉素敏感性 | 第29页 |
| 2.5 稳定转染Flp-In MDCK细胞株筛选 | 第29页 |
| 2.5.1 重组慢病毒感染MDCK细胞株 | 第29页 |
| 2.5.2 Flp-In MDCK细胞株筛选 | 第29页 |
| 2.6 Flp-In MDCK细胞株RT-PCR鉴定 | 第29-32页 |
| 2.6.1 RNA提取 | 第29-30页 |
| 2.6.2 RT反应 | 第30-31页 |
| 2.6.3 PCR反应 | 第31-32页 |
| 2.7 Flp-In MDCK细胞株β-半乳糖苷酶活性分析 | 第32页 |
| 3 结果 | 第32-37页 |
| 3.1 FRT-LacZ基因扩增 | 第32页 |
| 3.2 重组质粒酶切鉴定与测序鉴定 | 第32-34页 |
| 3.3 重组慢病毒的包装 | 第34页 |
| 3.4 病毒滴度测定 | 第34页 |
| 3.5 确定MDCK细胞嘌呤霉素敏感性 | 第34页 |
| 3.6 稳定转染Flp-In MDCK细胞筛选 | 第34-35页 |
| 3.7 Flp-In MDCK细胞RT-PCR鉴定 | 第35-36页 |
| 3.8 Flp-In MDCK细胞β-半乳糖苷酶活性分析 | 第36-37页 |
| 4 小结与分析 | 第37-38页 |
| 第二章 pcDNA5.0/FRT-siat7e定点整合表达载体构建 | 第38-48页 |
| 1 材料及仪器设备 | 第38-40页 |
| 1.1 材料及试剂 | 第38-39页 |
| 1.2 试剂配制 | 第39页 |
| 1.3 仪器设备 | 第39-40页 |
| 2 实验步骤及方法 | 第40-45页 |
| 2.1 目的基因的获取 | 第40-41页 |
| 2.1.1 引物设计 | 第40页 |
| 2.1.2 RCR获得目的基因 | 第40-41页 |
| 2.1.3 基因片段纯化 | 第41页 |
| 2.2 感受态细胞的制备 | 第41页 |
| 2.3 siat7e目的基因DNA片段的TA克隆 | 第41-42页 |
| 2.3.1 连接反应 | 第41-42页 |
| 2.3.2 重组质粒转化与蓝白斑筛选 | 第42页 |
| 2.3.3 质粒提取 | 第42页 |
| 2.3.4 酶切鉴定 | 第42页 |
| 2.4 pcDNA5/FRT与pMD18T-siat7e双酶切 | 第42-43页 |
| 2.5 DNA片段胶回收 | 第43页 |
| 2.6 连接反应 | 第43页 |
| 2.7 重组质粒转化与阳性克隆筛选 | 第43页 |
| 2.8 质粒提取 | 第43-44页 |
| 2.9 重组质粒PCR鉴定 | 第44页 |
| 2.10 重组质粒酶切鉴定 | 第44页 |
| 2.11 重组质粒大量制备 | 第44-45页 |
| 3 结果 | 第45-47页 |
| 3.1 RCR获得目的基因 | 第45页 |
| 3.2 感受态细胞的制备 | 第45页 |
| 3.3 pMD18T-siat7e载体酶切鉴定 | 第45-46页 |
| 3.4 pcDNA5/FRT-siat7e PCR鉴定 | 第46页 |
| 3.5 pcDNA5/FRT-siat7e酶切与测序鉴定 | 第46-47页 |
| 4 小结与分析 | 第47-48页 |
| 第三章 MDCK-siat7e细胞构建 | 第48-58页 |
| 1 材料及仪器设备 | 第48-49页 |
| 1.1 材料及试剂 | 第48-49页 |
| 1.2 仪器设备 | 第49页 |
| 2 实验步骤及方法 | 第49-53页 |
| 2.1 确定MDCK细胞潮霉素B敏感性 | 第49页 |
| 2.2 MDCK-siat7e细胞筛选 | 第49-50页 |
| 2.3 MDCK-siat7e细胞β-半乳糖苷酶活性分析 | 第50页 |
| 2.4 MDCK-siat7e细胞RT-PCR鉴定 | 第50-51页 |
| 2.4.1 RNA提取 | 第50页 |
| 2.4.3 RT反应 | 第50页 |
| 2.4.3 PCR反应 | 第50-51页 |
| 2.5 MDCK-siat7e细胞siat7e基因高表达株筛选 | 第51-52页 |
| 2.5.1 MDCK-siat7e细胞单细胞克隆 | 第51页 |
| 2.5.2 荧光定量PCR筛选 | 第51-52页 |
| 2.6 MDCK-siat7e细胞siat7e基因高表达株悬浮驯化 | 第52-53页 |
| 3 结果 | 第53-57页 |
| 3.1 确定MDCK细胞潮霉素B敏感性 | 第53页 |
| 3.2 MDCK-siat7e细胞筛选 | 第53页 |
| 3.3 MDCK-siat7e细胞β-半乳糖苷酶活性分析 | 第53-54页 |
| 3.4 MDCK-siat7e细胞RT-PCR鉴定 | 第54页 |
| 3.5 MDCK-siat7e细胞siat7e基因高表达株筛选 | 第54-55页 |
| 3.6 MDCK-siat7e细胞siat7e基因高表达株悬浮驯化 | 第55-57页 |
| 4 小结与分析 | 第57-58页 |
| 第三部分：结论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-64页 |
| 附录 缩略词英文对照表 | 第64-65页 |
| 硕士期间已发表论文 | 第65-66页 |
| 致谢 | 第66-67页 |
| 项目资金来源 | 第67页 |
