| 摘要 | 第1-16页 |
| Abstract | 第16-21页 |
| 缩略词表(ABBREVIATION) | 第21-22页 |
| 第一章 绪论 | 第22-34页 |
| ·5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid,ALA)简介 | 第22页 |
| ·ALA的应用领域与市场前景 | 第22-24页 |
| ·ALA在医学领域的应用价值 | 第22-23页 |
| ·ALA在农业领域的应用价值 | 第23-24页 |
| ·ALA的合成及其研究进展 | 第24-27页 |
| ·ALA的两种生物合成途径 | 第24-25页 |
| ·ALA合成的研究进展 | 第25-27页 |
| ·谷氨酸棒杆菌生产ALA的优势 | 第27-28页 |
| ·谷氨酸棒杆菌中heme的合成及其调控 | 第28-29页 |
| ·heme的功能 | 第28页 |
| ·heme的合成途径及其调控 | 第28-29页 |
| ·SsrA(tmRNA)蛋白降解标签 | 第29-30页 |
| ·利用RNA-Seq技术的转录组学研究 | 第30-31页 |
| ·本论文的研究工作与研究意义 | 第31-34页 |
| 第二章 谷氨酸棒杆菌中参与heme合成途径的关键基因的分离及功能验证 | 第34-61页 |
| ·实验材料 | 第35-42页 |
| ·菌株与质粒 | 第35-36页 |
| ·本章实验中所用的引物序列 | 第36-38页 |
| ·分子生物学常用酶、生化试剂及试剂盒 | 第38页 |
| ·仪器与设备 | 第38-40页 |
| ·实验室常用培养基及组成 | 第40页 |
| ·实验室常用抗生素及IPTG的配制 | 第40页 |
| ·实验中的分子生物学常用溶液及Buffer缓冲液的配制 | 第40-42页 |
| ·实验方法 | 第42-50页 |
| ·菌种的保藏方法 | 第42页 |
| ·实验室中常用的分子生物学操作技术 | 第42-43页 |
| ·重组质粒pGX、pHA和pHHL的构建 | 第43-46页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第43页 |
| ·PCR扩增 | 第43页 |
| ·PCR产物的胶回收 | 第43-44页 |
| ·质粒pUC19的提取 | 第44页 |
| ·PCR扩增片段与质粒pUC19的酶切 | 第44页 |
| ·体外连接目的基因和质粒载体 | 第44-45页 |
| ·大肠杆菌DH5α化学感受态的制备 | 第45页 |
| ·大肠杆菌的化学转化 | 第45页 |
| ·重组子的筛选与鉴定 | 第45-46页 |
| ·重组质粒pEGX、pEHA、pEHL、pCGAL和pPALX的构建 | 第46-47页 |
| ·PCR扩增与胶回收 | 第46页 |
| ·质粒pECXK99E的提取与酶切 | 第46-47页 |
| ·体外连接目的基因和质粒载体并转化大肠杆菌 | 第47页 |
| ·互补实验所用菌株的获得 | 第47页 |
| ·大肠杆菌PD19、PDGX、PDHA和PDHL菌株的获得 | 第47-48页 |
| ·谷氨酸棒杆菌PECX、PEGX、PEHA、PEHL、CGAL和PALX菌株的获得 | 第48页 |
| ·谷氨酸棒杆菌感受态的制备 | 第48页 |
| ·谷氨酸棒杆菌的电击转化 | 第48页 |
| ·大肠杆菌的发酵培养 | 第48-49页 |
| ·谷氨酸棒杆菌的发酵培养 | 第49页 |
| ·发酵产物的检测 | 第49-50页 |
| ·结果与讨论 | 第50-59页 |
| ·谷氨酸棒杆菌中gltX、hemA和hemL的克隆与分析 | 第50-52页 |
| ·通过互补实验验证gltX、hemA和hemL | 第52-54页 |
| ·通过大肠杆菌发酵实验验证gltX、hemA和hemL | 第54-55页 |
| ·ALA、PBG与heme标准曲线的建立 | 第55-56页 |
| ·通过谷氨酸棒杆菌的发酵实验验证gltX、hemA和hemL | 第56-57页 |
| ·在CGAL中添加LA提高ALA的积累 | 第57-58页 |
| ·改变CGAL培养基中Mg~(2+)与Mn~(2+)的浓度提高ALA的积累 | 第58-59页 |
| ·本章小结 | 第59-61页 |
| 第三章 通过改造谷氨酸棒杆菌提高5-氨基乙酰丙酸的积累 | 第61-81页 |
| ·实验材料 | 第62-64页 |
| ·菌株与质粒 | 第62-63页 |
| ·本章实验中所用的引物序列 | 第63-64页 |
| ·实验方法 | 第64-67页 |
| ·质粒pCEAL、pSCAL、pSEAL、pPALX、pPSEC、pPSEE及pPSER的构建 | 第64-65页 |
| ·谷氨酸棒杆菌菌株CEAL、SCAL、SEAL、PSEC、PS EE和PSER的获得 | 第65页 |
| ·谷氨酸棒杆菌中无标记基因整合与敲除技术 | 第65页 |
| ·构建ALAD弱化的谷氨酸棒杆菌菌株HBAS和HBAA | 第65-67页 |
| ·发酵产物的检测 | 第67页 |
| ·转录组测序分析 | 第67页 |
| ·结果与讨论 | 第67-79页 |
| ·在谷氨酸棒杆菌中过表达不同来源的hemA和hemL提高ALA的积累 | 第67-69页 |
| ·利用转录组测序技术分析影响ALA合成的关键因素 | 第69-71页 |
| ·对SEAL的接种量进行优化 | 第71-72页 |
| ·通过添加各种不同的抑制剂来弱化heme下游合成途径 | 第72-75页 |
| ·通过对ALAD进行分子水平的修饰来降低酶活 | 第75-77页 |
| ·在SEAL1中添加不同抑制剂来降低ALAD的酶活 | 第77-78页 |
| ·尝试在SEAL中过表达转运蛋白rhtA提高ALA的积累 | 第78-79页 |
| ·本章小结 | 第79-81页 |
| 第四章 通过转录组测序技术分析5-氨基乙酰丙酸的积累对谷氨酸棒杆菌菌体产生的生理影响 | 第81-102页 |
| ·实验材料 | 第81-83页 |
| ·菌株与质粒 | 第81-82页 |
| ·本章实验中所用的引物序列 | 第82-83页 |
| ·实验方法 | 第83-88页 |
| ·转录组测序样品的取样和保存方法 | 第83页 |
| ·华大基因转录组测序与分析流程 | 第83-87页 |
| ·hrrA基因的敲除 | 第87-88页 |
| ·结果与讨论 | 第88-101页 |
| ·在谷氨酸棒杆菌中过表达外源的hemA和hemL后对生长和糖耗的影响 | 第88页 |
| ·转录组测序后的数据分析 | 第88-92页 |
| ·对SEAL进行代谢途径与生理变化的比较与分析 | 第92-97页 |
| ·ALA积累对heme合成途径的影响 | 第97-99页 |
| ·heme合成对呼吸代谢途径的影响 | 第99-101页 |
| ·本章小结 | 第101-102页 |
| 第五章 利用双组份系统HrrSA和ChrSA提高5-氨基乙酰丙酸的积累 | 第102-109页 |
| ·实验材料 | 第102-104页 |
| ·菌株与质粒 | 第102-103页 |
| ·本章实验中所用的引物序列 | 第103-104页 |
| ·实验方法 | 第104-105页 |
| ·表达质粒pealoab的构建 | 第104页 |
| ·谷氨酸棒杆菌菌株SEOAB、SEOAB1、SEOAB2和SEOAB3的获得 | 第104-105页 |
| ·发酵产物的检测 | 第105页 |
| ·结果与讨论 | 第105-108页 |
| ·双组份系统HrrSA和ChrSA | 第105-106页 |
| ·利用双组份系统HrrSA和ChrSA的调控机理构建积累ALA的菌株 | 第106-107页 |
| ·在菌株SEOAB中添加抑制剂来提高ALA积累的探索 | 第107-108页 |
| ·本章小结 | 第108-109页 |
| 全文总结 | 第109-112页 |
| 参考文献 | 第112-123页 |
| 致谢 | 第123-125页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第125-126页 |
| 附录 | 第126-135页 |
