| 符号说明 | 第1-5页 |
| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-14页 |
| 第一部分 研究论文 | 第14-85页 |
| 第一章 绒山羊CRISP1的融合蛋白原核表达及融合蛋白的分离纯化 | 第14-32页 |
| 前言 | 第14-16页 |
| 一、材料和方法 | 第16-24页 |
| ·材料 | 第16-18页 |
| ·实验器材 | 第16页 |
| ·实验试剂 | 第16-17页 |
| ·实验载体 | 第17页 |
| ·实验菌种 | 第17页 |
| ·常用溶液配制 | 第17-18页 |
| ·实验方法 | 第18-24页 |
| ·合成引物 | 第18-19页 |
| ·过渡载体的构建 | 第19页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第19-20页 |
| ·融合蛋白诱导表达 | 第20页 |
| ·表达蛋白的SDS-PAGE电泳鉴定 | 第20-21页 |
| ·融合蛋白的Western鉴定 | 第21-22页 |
| ·融合蛋白的可溶性及包涵体分析 | 第22页 |
| ·融合蛋白的切胶纯化 | 第22页 |
| ·Bradford法测蛋白浓度 | 第22-24页 |
| 二、结果 | 第24-31页 |
| ·CRISP1全长测序结果分析 | 第24-25页 |
| ·重组克隆T载体的构建与pET32a-CRISP1重组载体酶切及测序鉴定 | 第25-26页 |
| ·pET32a-CRISP1在大肠杆菌中的诱导表达与His-CRISP1融合蛋白的Western-blot鉴定 | 第26-28页 |
| ·融合蛋白的包涵体分析 | 第28页 |
| ·融合蛋白的分离纯化结果 | 第28-31页 |
| 三、讨论 | 第31-32页 |
| 第二章 绒山羊CRISP1腹水多克隆抗体制备及纯化 | 第32-41页 |
| 前言 | 第32-33页 |
| 一、材料和方法 | 第33-38页 |
| ·材料 | 第33-34页 |
| ·实验器材 | 第33页 |
| ·实验试剂 | 第33页 |
| ·细胞 | 第33页 |
| ·实验动物 | 第33-34页 |
| ·实验方法 | 第34-38页 |
| ·腹水瘤细胞培养 | 第34-35页 |
| ·多克隆抗体的制备 | 第35页 |
| ·多克隆抗体的特异性检测 | 第35-36页 |
| ·多克隆抗体的效价测定 | 第36-38页 |
| 二、结果 | 第38-40页 |
| ·多克隆抗体的鉴定与特异性分析 | 第38页 |
| ·抗体的效价测定 | 第38-40页 |
| 三、讨论 | 第40-41页 |
| 第三章 CRISP1蛋白在山羊睾丸组织和精子中的定位检测 | 第41-49页 |
| 前言 | 第41-42页 |
| 一、材料和方法 | 第42-45页 |
| ·材料 | 第42-43页 |
| ·实验器材 | 第42页 |
| ·实验试剂 | 第42页 |
| ·实验动物 | 第42页 |
| ·常用试剂的配方 | 第42-43页 |
| ·实验方法 | 第43-45页 |
| ·绒山羊睾丸组织CRISP1定位 | 第43-44页 |
| ·在精子中定位CRISP1 | 第44-45页 |
| 二、结果 | 第45-48页 |
| ·绒山羊睾丸组织中CRISP1的定位 | 第45-46页 |
| ·精子细胞顶体反应前后不同形态的免疫化学定位 | 第46-48页 |
| 三、讨论 | 第48-49页 |
| 第四章 绒山羊CRISP1与PDIA3蛋白相互作用研究 | 第49-75页 |
| 前言 | 第49-51页 |
| 一、材料与方法 | 第51-62页 |
| ·材料 | 第51-53页 |
| ·实验器材 | 第51页 |
| ·试剂 | 第51-52页 |
| ·实验载体 | 第52页 |
| ·细胞及酵母菌株 | 第52-53页 |
| ·实验方法 | 第53-62页 |
| ·酵母载体所需序列的PCR扩增 | 第53页 |
| ·酵母载体重组 | 第53页 |
| ·制备与转化酵母感受态 | 第53-55页 |
| ·PCR鉴定阳性酵母 | 第55-56页 |
| ·Y2H中诱饵蛋白的毒性检测和自激活检测 | 第56页 |
| ·Y2H与Y187的杂交 | 第56页 |
| ·PCR扩增pcDNA-CRISP1所需cDNA序列 | 第56-57页 |
| ·构建pcDNA-CRISP1、pcDNA-CRISP1(A段)、pcDNA-CRISP1(B段)真核表达载体 | 第57页 |
| ·293T细胞培养 | 第57-58页 |
| ·转染细胞 | 第58页 |
| ·蛋白收集 | 第58-59页 |
| ·免疫共沉淀(CO-IP) | 第59页 |
| ·Western blot检测 | 第59-60页 |
| ·含有GST标签蛋白原核表达载体的构建 | 第60页 |
| ·GST融合蛋白表达 | 第60页 |
| ·GST-pull down验证蛋白相互作用 | 第60-62页 |
| 二、结果 | 第62-73页 |
| ·CRISP1与PDIA3的氨基酸序列与结构域分析 | 第62页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第62-65页 |
| ·酵母阳性菌落PCR鉴定 | 第65页 |
| ·酵母杂交形成三聚体 | 第65-66页 |
| ·酵母四缺板 | 第66-67页 |
| ·真核表达载体构建 | 第67-68页 |
| ·免疫共沉淀及western结果 | 第68-70页 |
| ·原核表达载体PGEX-PDIA3构建 | 第70-72页 |
| ·GST pull-down结果 | 第72-73页 |
| 三、讨论 | 第73-75页 |
| 第五章 绒山羊CRISP1与PDIA3蛋白的真核单克隆稳定细胞系的建立 | 第75-85页 |
| 前言 | 第75-76页 |
| 一 材料和方法 | 第76-81页 |
| ·实验材料 | 第76-77页 |
| ·实验器材 | 第76页 |
| ·实验试剂 | 第76-77页 |
| ·实验细胞和载体 | 第77页 |
| ·实验方法 | 第77-81页 |
| ·构建pIRES-CRISP1和pIRES-PDIA3所需cDNA的PCR扩增 | 第77页 |
| ·构建pIRES-CRISP1、pIRES-PDIA3真核表达载体 | 第77-78页 |
| ·Hela细胞培养 | 第78页 |
| ·制备筛选培养基 | 第78页 |
| ·细胞转染 | 第78-79页 |
| ·单克隆稳定筛选细胞 | 第79-81页 |
| 二、结果 | 第81-84页 |
| ·构建红色荧光真核表达载体 | 第81-83页 |
| ·单克隆稳定细胞筛选 | 第83-84页 |
| 三、讨论 | 第84-85页 |
| 第二部分 文献综述 精子膜蛋白CRISP1的功能和在受精过程中的分子机制 | 第85-93页 |
| 参考文献 | 第93-96页 |
| 致谢 | 第96-98页 |
| 读硕士期间参与的科研项目和发表的学术论文 | 第98页 |
