| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-16页 |
| 第一章 综述 | 第16-24页 |
| 1.喜树碱概况 | 第16-19页 |
| ·植物次生代谢工程 | 第16页 |
| ·喜树碱概述 | 第16-17页 |
| ·喜树萜类吲哚生物碱的合成途径 | 第17-18页 |
| ·喜树萜类吲哚生物碱的合成途径中的关键酶STR | 第18-19页 |
| ·日本蛇根草 | 第19页 |
| 2.植物凝集素概况 | 第19-22页 |
| ·凝集素定义 | 第19-20页 |
| ·植物凝集素的分类 | 第20页 |
| ·植物凝集素的性质 | 第20-21页 |
| ·植物凝集素的功能 | 第21页 |
| ·植物凝集素在抗虫基因工程中的应用 | 第21-22页 |
| ·龟背竹 | 第22页 |
| 3 本研究的目标及拟解决的问题 | 第22-24页 |
| 第二章 材料和方法 | 第24-38页 |
| ·材料 | 第24-26页 |
| ·植物材料 | 第24页 |
| ·菌种 | 第24页 |
| ·载体 | 第24页 |
| ·试剂及溶液 | 第24页 |
| ·主要仪器 | 第24-25页 |
| ·常用试剂 | 第25-26页 |
| ·实验方法 | 第26-33页 |
| ·日本蛇根草总RNA的提取与检测 | 第26页 |
| ·准备工作 | 第26页 |
| ·用TIANGENRNA prep植物总RNA提取试剂盒抽提日本蛇根草总RNA | 第26页 |
| ·检测RNA的质量与纯度 | 第26页 |
| ·日本蛇根草异胡豆苷合成酶编码基因(OjSTR)的克隆 | 第26-30页 |
| ·3'RACE | 第26-27页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第26页 |
| ·3'端cDNA片段扩增 | 第26-27页 |
| ·5'RACE | 第27-29页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第27页 |
| ·5'端cDNA片段扩增 | 第27-29页 |
| ·OjSTR ORF的扩增 | 第29页 |
| ·凝胶电泳条带或酶切产物的柱层析纯化回收 | 第29页 |
| ·DNA回收片段与pMD18-T easy vector载体的连接 | 第29页 |
| ·大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备(CaCl_2法) | 第29-30页 |
| ·DNA与pMD18-T easy Vector的连接产物转化DH5α感受态细胞 | 第30页 |
| ·阳性克隆的筛选及测序鉴定 | 第30页 |
| ·OjSTR在日本蛇根草的根、茎、叶、花的RT-PCR分析 | 第30页 |
| ·RNA的提取 | 第30页 |
| ·RT-PCR | 第30页 |
| ·甲基茉莉酸(MJ)对OjSTR在日本蛇根草中表达影响的RT-PCR分析 | 第30-31页 |
| ·甲基茉莉酸(MJ)对日本蛇根草植株的诱导处理 | 第30-31页 |
| ·RT-PCR检测 | 第31页 |
| ·水杨酸(SA)对OjSTR在日本蛇根草中表达影响的RT-PCR分析 | 第31页 |
| ·水杨酸(SA)对日本蛇根草植株的诱导处理 | 第31页 |
| ·RT-PCR检测 | 第31页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第31-32页 |
| ·植物表达载体pCAMBIA1304~+的构成 | 第31页 |
| ·植物表达载体pCAMBIA1304~+-OjSTR的构建 | 第31-32页 |
| ·植物表达载体转化发根农杆菌C58C1 | 第32-33页 |
| ·发根农杆菌C58C1感受态细胞的制备 | 第32页 |
| ·携带表达载体pCAMBIA1304~+-OjSTR的C58C1获得 | 第32-33页 |
| ·C58C1介导的pCAMBIA1304~+-OjSTR遗传转化 | 第33页 |
| ·携带植物表达载体pCAMBIA1304~+-OjSTR的C58C1的保存和活化 | 第33页 |
| ·喜树下胚轴的预培养 | 第33页 |
| ·农杆菌与喜树下胚轴外植体的共培养 | 第33页 |
| ·毛状根的诱导和培养 | 第33页 |
| ·龟背竹凝集素基因的克隆 | 第33-38页 |
| ·龟背竹叶RNA的提取与检测 | 第33-34页 |
| ·准备工作 | 第34页 |
| ·龟背竹叶RNA抽提 | 第34页 |
| ·检测RNA的质量与纯度 | 第34页 |
| ·龟背竹凝集素编码基因(MDA)的克隆 | 第34-36页 |
| ·MDA 3'RACE | 第34页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第34页 |
| ·MDA3'端cDNA片段扩增 | 第34页 |
| ·MDA5'RACE | 第34-35页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第34-35页 |
| ·5'端cDNA片段扩增 | 第35页 |
| ·MDAORF的扩增 | 第35页 |
| ·凝胶电泳条带的柱层析纯化回收 | 第35页 |
| ·DNA回收片段与pMD18-T easy vector(Takara)载体的连接 | 第35页 |
| ·大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备(CaCl_2法) | 第35页 |
| ·DNA与pMD18-T easy Vector的连接产物转化DH5α感受态细胞 | 第35-36页 |
| ·阳性克隆的筛选及测序鉴定 | 第36页 |
| ·MDA在龟背竹根、茎、叶中的RT-PCR分析 | 第36页 |
| ·龟背竹RNA的提取 | 第36页 |
| ·.2 RT-PCR鉴定 | 第36页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第36-37页 |
| ·植物表达载体pCAMBIA1304~+的构建 | 第36页 |
| ·植物表达载体pCAMBIA1304~+-MDA的构建 | 第36-37页 |
| ·携带植物表达载体pCAMBIA1304~+-MDA的根癌农杆菌EHA105介导遗传转化烟草 | 第37-38页 |
| ·根癌农杆菌EHA105(pCAMBIA1304~+-MDA)的培养 | 第37页 |
| ·烟草无菌苗的准备 | 第37页 |
| ·烟草植株的遗传转化 | 第37页 |
| ·植物DNA的抽提 | 第37-38页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第38-60页 |
| ·日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因的克隆分析 | 第38-49页 |
| ·日本蛇根草总RNA的提取 | 第38页 |
| ·日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因(OjSTR)的克隆 | 第38-39页 |
| ·OjSTR的3'RACE | 第38-39页 |
| ·OjSTR的5'RACE | 第39页 |
| ·OjSTR基因开放阅读框的扩增、序列分析及蛋白质二、三级结构预测 | 第39-43页 |
| ·OjSTR的分子进化分析 | 第43-44页 |
| ·日本蛇根草异胡豆合成酶基因(OjSTR)的表达部位特异性分析 | 第44页 |
| ·甲基茉莉酸对日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因的诱导 | 第44-45页 |
| ·水杨酸对日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因的诱导 | 第45-46页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第46-47页 |
| ·PCR扩增OjSTR基因 | 第46页 |
| ·植物表达载体pCAMBIA1304~+-OjSTR的构建 | 第46-47页 |
| ·植物表达载体转化发根农杆菌C58C1 | 第47页 |
| ·喜树毛状根的诱导和培养 | 第47-48页 |
| ·喜树毛状根的诱导 | 第47-48页 |
| ·喜树状根液体培养 | 第48页 |
| ·小结 | 第48-49页 |
| ·龟背竹凝集素基因(MDA)的克隆 | 第49-60页 |
| ·龟背竹总RNA的提取 | 第49页 |
| ·MDA的3'RACE | 第49-50页 |
| ·MDA的5'RACE | 第50页 |
| ·MDA基因开放阅读框的扩增、序列分析及蛋白质二、三级结构预测 | 第50-54页 |
| ·MDA分子进化分析 | 第54-55页 |
| ·龟背竹凝集素基因(MDA)的表达部位特异性分析 | 第55-56页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第56-57页 |
| ·PCR扩增MDA基因 | 第56页 |
| ·植物表达载体的构建pCAMBIA1304~+-MDA | 第56-57页 |
| ·植物表达载体(pCAMBIA1304~+-MDA)转化根癌农杆菌EHA105 | 第57页 |
| ·烟草的遗传转化 | 第57-58页 |
| ·转基因烟草的PCR检测 | 第58-59页 |
| ·小结 | 第59-60页 |
| 第四章 论文小结与展望 | 第60-63页 |
| ·日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因的克隆分析 | 第60-61页 |
| ·龟背竹凝集素基因的克隆与分析 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-71页 |
| 附录:硕士期间发表论文(含待发表): | 第71-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
