| 中文摘要 | 第3-4页 |
| 英文摘要 | 第4-10页 |
| 1 引言 | 第10-18页 |
| 1.1 基因组编辑技术 | 第10-12页 |
| 1.1.1 基因组编辑技术概述 | 第10-11页 |
| 1.1.2 基因组编辑技术发展历程 | 第11页 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas与ZFN、TALEN比较 | 第11-12页 |
| 1.2 CRISPR/Cas系统 | 第12-13页 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas系统基本结构 | 第12页 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas系统技术原理 | 第12-13页 |
| 1.3 CRISPR/Cas系统在植物中的应用 | 第13-16页 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9系统在植物中应用 | 第13-14页 |
| 1.3.1.1 NHEJ介导的基因编辑 | 第13-14页 |
| 1.3.1.2 HDR介导的基因定点插入或替换 | 第14页 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas13a系统在植物中的应用 | 第14-16页 |
| 1.3.2.1 Cas13a与Cas9、Cpf1比较 | 第15页 |
| 1.3.2.2 Cas13a与RNAi比较 | 第15-16页 |
| 1.4 研究意义及主要研究内容 | 第16-17页 |
| 1.5 创新点 | 第17页 |
| 1.6 技术路线 | 第17-18页 |
| 2 CRISPR/Cas9基因敲除载体构建 | 第18-31页 |
| 2.1 实验材料 | 第18页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第18页 |
| 2.1.2 实验试剂 | 第18页 |
| 2.1.3 载体和引物 | 第18页 |
| 2.1.4 常用培养基及抗生素的配制 | 第18页 |
| 2.2 实验方法 | 第18-25页 |
| 2.2.1 番茄幼苗叶片总RNA提取 | 第18-19页 |
| 2.2.2 RT-PCR方法获取cDNA | 第19-20页 |
| 2.2.3 PCR扩增目标番茄基因片段 | 第20页 |
| 2.2.4 sgRNA的设计 | 第20-21页 |
| 2.2.5 sgRNA表达盒的构建 | 第21-24页 |
| 2.2.5.1 PYLCRISPR/CAS9Pubi-N、pYLsgRNA-AtU3b/LacZ质粒提取 | 第21页 |
| 2.2.5.2 构建sgRNA表达盒 | 第21-23页 |
| 2.2.5.3 胶回收 | 第23-24页 |
| 2.2.6 Cas9表达载体的构建 | 第24页 |
| 2.2.6.1 Cas9质粒酶切 | 第24页 |
| 2.2.6.2 酶切后回收 | 第24页 |
| 2.2.7 CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建 | 第24-25页 |
| 2.2.7.1 将sgRNA表达盒克隆到PYLCRISPR/CAS9Pubi-N载体 | 第24-25页 |
| 2.2.7.2 连接产物转化 | 第25页 |
| 2.2.7.3 阳性重组质粒的筛选 | 第25页 |
| 2.3 实验结果与分析 | 第25-30页 |
| 2.3.1 番茄幼苗叶片总RNA提取 | 第25-26页 |
| 2.3.2 番茄Piezo基因片段扩增 | 第26页 |
| 2.3.3 载体质粒DNA的提取 | 第26-27页 |
| 2.3.4 基因敲除靶位点的设计与合成 | 第27-28页 |
| 2.3.5 Overlaping PCR构建sgRNA表达盒 | 第28页 |
| 2.3.6 Cas9表达载体构建 | 第28-29页 |
| 2.3.7 重组载体质粒的提取 | 第29页 |
| 2.3.8 重组质粒引物扩增鉴定 | 第29-30页 |
| 2.4 讨论 | 第30-31页 |
| 3 西红柿抗ToMV病毒载体构建 | 第31-47页 |
| 3.1 实验材料 | 第31页 |
| 3.1.1 菌株 | 第31页 |
| 3.1.2 酶、实验试剂盒 | 第31页 |
| 3.1.3 载体和引物 | 第31页 |
| 3.2 实验方法 | 第31-41页 |
| 3.2.1 合成西红柿密码子优化的的Cas13a | 第31-32页 |
| 3.2.2 Cas13a表达体系构建 | 第32-35页 |
| 3.2.2.1 扩增Pubi启动子 | 第32-33页 |
| 3.2.2.2 扩增Cas13a | 第33-34页 |
| 3.2.2.3 扩增终止子 | 第34-35页 |
| 3.2.2.4 Cas13a表达体系各元件连接 | 第35页 |
| 3.2.3 串联crRNA系统 | 第35-39页 |
| 3.2.3.1 crRNA合成 | 第36-37页 |
| 3.2.3.2 启动子的分析与获取 | 第37-38页 |
| 3.2.3.3 PCR连接 | 第38-39页 |
| 3.2.4 合适的植物表达体系元件 | 第39-40页 |
| 3.2.5 各种质粒元件整合 | 第40-41页 |
| 3.2.5.1 阳性克隆的鉴定 | 第40-41页 |
| 3.3 实验结果与分析 | 第41-45页 |
| 3.3.1 Pubi启动子与Cas13a的扩增 | 第41页 |
| 3.3.2 Pubi启动子与Cas13a连接片段 | 第41-42页 |
| 3.3.3 扩增终止子片段 | 第42-43页 |
| 3.3.4 构建Cas13a表达体系 | 第43页 |
| 3.3.5 扩增U3启动子与crRNA | 第43-44页 |
| 3.3.6 U3启动子与crRNA片段连接 | 第44页 |
| 3.3.7 扩增合适的植物表达元件 | 第44-45页 |
| 3.3.8 抗病毒载体质粒 | 第45页 |
| 3.4 讨论 | 第45-47页 |
| 4 重组载体的转化 | 第47-50页 |
| 4.1 实验材料 | 第47页 |
| 4.2 实验方法 | 第47-48页 |
| 4.2.1 农杆菌感受态细胞制备 | 第47页 |
| 4.2.2 重组质粒转化农杆菌 | 第47页 |
| 4.2.3 农杆菌转化子的筛选 | 第47-48页 |
| 4.3 实验结果与分析 | 第48-49页 |
| 4.3.1 Piezo基因敲除载体转化 | 第48页 |
| 4.3.2 西红柿抗ToMV病毒载体转化 | 第48-49页 |
| 4.4 讨论 | 第49-50页 |
| 5 结论与展望 | 第50-52页 |
| 5.1 结论 | 第50页 |
| 5.1.1 Piezo基因敲除载体构建 | 第50页 |
| 5.1.2 西红柿抗ToMV病毒载体构建 | 第50页 |
| 5.1.3 载体转化农杆菌 | 第50页 |
| 5.2 展望 | 第50-52页 |
| 参考文献 | 第52-59页 |
| 附录 | 第59-63页 |
| 附录1 文中所用引物 | 第59-60页 |
| 附录2 主要仪器 | 第60-61页 |
| 附录3 文中涉及的DNA序列 | 第61-63页 |
| 后记 | 第63-64页 |
| 攻读学位期间取得的科研成果清单 | 第64页 |
